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Na+ K+-ATP 酶活性測(cè)定說明書

來源:上海研謹(jǐn)生物科技有限公司   2019年05月13日 18:51  

貨號(hào):YJ2218                                                  規(guī)格:50管/24樣

Na+ K+-ATP 酶活性測(cè)定說明書

可見分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義:

Na+ K+- ATP 酶廣泛分布于植物、動(dòng)物、微生物和細(xì)胞中,可催化ATP水解生成 ADP和無機(jī)磷。

測(cè)定原理:

Na+ K+-ATP 酶分解ATP生成ADP及無機(jī)磷,通過測(cè)定無機(jī)磷的量來確定 ATP 酶活性。

需自備的儀器和用品:

可見分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸

餾水。

試劑的組成和配制:

提取液:液體 50mL×1 瓶,4℃保存。

試劑一:液體 10mL×1 瓶,4℃保存。

試劑二:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑三:液體 5ml×1 瓶,4℃保存。

試劑四:粉劑×3支,-20℃保存。用時(shí)每支加1mL蒸餾水,現(xiàn)用現(xiàn)配。用不完的試劑-20℃

可保存一周。

試劑五:液體 5mL×1 瓶,4℃保存。

試劑六:粉劑×1 瓶,4℃保存。用時(shí)加入 3mL 蒸餾水, 4℃保存。

試劑七:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑八:粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時(shí)加入 25mL 蒸餾水,溶解后 4℃保存一周。

試劑九:液體 25mL×1 瓶,室溫保存。

試劑十:10mmol/L 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10mL×1 瓶,4℃保存。

0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制:將貯備液20倍稀釋,即取0.1mL試劑十加1.9mL蒸餾水

         充分混勻。

定磷劑的配制:按 H2O: 試劑七:試劑八:試劑九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷劑應(yīng)為淺黃色。若無色則試劑失效,若是藍(lán)色則為磷污染,定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

樣品酶液的制備:

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

操作步驟

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至660nm,蒸餾水調(diào)零。

2、酶促反應(yīng)(在 EP 管中加入下列試劑)

 

對(duì)照管  

測(cè)定管

試劑一(μL)    

130

90

試劑二(μL)    

40

40

試劑三(μL)    

40

40

試劑四(μL)    

40

40

試劑五(μL)  

 

40

樣本 (μL)  

 

200

混勻,37℃(哺乳動(dòng)物)或 25℃(其他物種)準(zhǔn)確水浴 10min

試劑六(μL)    

50

50

樣本 (μL)

200

 

混勻,8000g,25℃離心 10min,取上清液

3 定磷(在 1.5mLEP 管中依次加入下列試劑)

 

空白管

標(biāo)準(zhǔn)管

對(duì)照管

測(cè)定管

0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷

應(yīng)用液(μL)

 

100

 

 

上清液(μL)

 

 

100

100

蒸餾水(μL)

100

 

 

 

定磷試劑(μL)

1000

1000

1000

1000

混勻,室溫放置 30 min,在 660nm 處比色。

注意:

1、由于每一個(gè)樣都必須做對(duì)照,本試劑盒50管保證測(cè)24份 Na+ K+ -ATP 酶。

2、此法具有微量、靈敏、快速的特點(diǎn)。所以對(duì)測(cè)定所用試管要求嚴(yán)格無磷。

3、空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只要做一管。

計(jì)算

1、血清(漿)Na+ K+-ATPase 活力的計(jì)算:

定義:每小時(shí)每毫升血清(漿)中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力(μmol/h/mL)=[C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A

空白管)÷V 樣÷T=7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+ K+-ATPase 活力的計(jì)算:

(1)按蛋白濃度計(jì)算:

定義:每小時(shí)每毫克組織蛋白中 Na+ K+-ATP酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+ K+-ATP酶活力(μmol/h /mg)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(Cpr×V 樣)÷T =7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷Cpr

(2)按樣本鮮重計(jì)算:

定義:每小時(shí)每克組織中Na+ K+ -ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

 

Na+ K+-ATP 酶活力(μmol/h/g)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T=7.5×(A 測(cè)定管-A 對(duì)照管)÷(A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管)÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

定義:每小時(shí)每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞中 Na+ K+-ATP 酶分解ATP產(chǎn)生1μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)酶活力單位。

Na+ K+-ATP 酶活力(μmol/h /104)= [C標(biāo)準(zhǔn)管×V總]×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.015×(A測(cè)定管-A對(duì)照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

 

C 標(biāo)準(zhǔn)管:標(biāo)準(zhǔn)管濃度,0.5μmol/mL;V 總:酶促反應(yīng)總體積,0.5mL;V 樣:加入樣本體

積,0.2mL ;V 樣總:加入提取液體積,1mL;T:反應(yīng)時(shí)間,1/6 小時(shí);Cpr:樣本蛋白質(zhì)

濃度,mg/mL;W:樣本鮮重,g;500:細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),500 萬。

 

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