一. 實驗前準備:
1.將水浴鍋預熱至37℃
2.用75%酒精擦拭紫外線照射30min的超凈工作臺臺面。
3.在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養(yǎng)瓶等等。
二.取出凍存管:
1.根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
2.從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號。
三.迅速解凍:
1.迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中迅速解凍,并要不斷的搖動,使管中的液體迅速融化。
2.約1-2min后凍存管內液體*溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。
四.平衡離心:用架盤天平平衡后,放入離心機中3000r/min 離心3min
五.制備細胞懸液:
1.吸棄上清液。
2.向離心管內加入10ml培養(yǎng)液,吹打制成細胞懸液。
六.細胞計數(shù):細胞濃度以5×105/ml為宜。
七.培養(yǎng)細胞:
將復合細胞計數(shù)要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內,將培養(yǎng)瓶放入37℃5%CO2的培養(yǎng)箱內2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續(xù)培養(yǎng)培養(yǎng),換液的時間由細胞情況而定。
初學者易犯錯誤:
1.一次復蘇細胞過多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。
2水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃。
3.水浴鍋內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長。
4.離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
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