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原代角質形成細胞的分離培養方法

來源:http://www.icellbioscience.com/news/ScienceContent/1362   2019年07月24日 10:11  

原代細胞在相關細胞實驗使用過程中越來越多,人們不再單單趨于使用細胞系進行實驗研究,因為細胞系常常由于體外長期培養,而容易丟失原有的生物學特性,對藥物處理的反應差距越來越大。
 
原代細胞剛從組織中分離開,生物學特性未發生很大變化,仍保留原來的遺傳特性,也接近和反應體內生長特性,原代細胞的活力和生長狀態都比較好,細胞的純度和基因保留可達到90%以上,適宜用于藥物敏感性試驗、細胞分化等試驗研究,使用原代細胞進行實驗,可以獲得更準確的研究和數據。
 
為了更好的服務于廣大科研工作者,鏡像綺點技術人員特提供了角質形成細胞分離的常用方法,技術因人而異僅供參考:
 
角質形成細胞是一種不斷分化的復層鱗狀上皮細胞,其分化的終階是形成角蛋白。根據角質形成細胞的發展階段和特點,從內向外可將其分為五層。基底細胞層又稱生發層,棘細胞層,顆粒層,透明層,角質層。
 
角質形成細胞的分化成熟表現為從基底層到向角質層的逐漸移行。在單一移行過程中,角質形成;細胞的形狀和功能也逐漸發生著變化,從單層柱狀上皮的基底層到扁平的細胞核消失的角質層。新生的基底細胞進入棘細胞層,然后上移到顆粒層的上層。細胞組織來源于實驗動物的正常皮膚組織,細胞生長狀態為貼壁培養。
 

 

需要的實驗試劑:
1.培養基1:iCell原代角質細胞培養體系
4.基礎培養基:DMEM/F12
5.緩沖液:無菌不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S,pH=7.4
6.消化液1:1.2U/ml的dispase Ⅱ
7.消化液2:0.25%胰蛋白酶+0.02mM EDTA
8.消化液3:0.1%Ⅰ型膠原酶
9.75%醫用酒精
10.胎牛血清(FBS)
 
實驗器械:
1.培養皿
2.T-25細胞培養瓶
3.100目不銹鋼網篩
4.200目不銹鋼網篩
5.眼科剪
6.眼科鑷
7.離心管(15ml、50ml)
 
實驗步驟:
1.新鮮的包皮組織,裝盛于含有無菌生理鹽水或1×PBS的無菌容器中,于保溫盒中,冰上放置離體6h內運輸到實驗室進行后續分離。
2.在無菌環境中取出包皮組織,用1×PBS清洗2-3次去除表面血液后,75%的酒精浸泡100s
3.酒精浸泡組織后快速將組織轉入裝有1×PBS的培養皿中震蕩清洗數次以去除酒精,然后用眼科剪小心剪去皮下組織(脂肪,微血管等)
4.將去除了脂肪和微血管組織的再用1×PBS清洗幾次后,剪成3mm*8mm左右的皮片,用消化液1  4度消化過夜(15-18h)。
5.第二天,用2個眼科鑷子小心撕開過夜消化的皮膚組織,分離和表皮;
6.分離的表皮用眼科剪剪碎后用消化液3 37度水浴消化1h。
7.消化完成后用移液器充分吹打100次左右,然后用含血清的培養基終止消化,過200目不銹鋼網篩后取濾懸液,轉入15ml離心管中,400g離心10分鐘,離心完成后棄去上清,沉淀用3ml的1×PBS吹打重懸后,400g離心5min離心完成后棄去上清,沉淀用2ml的原代角質細胞培養基吹打重懸后,轉入已經裝有2ml培養基的T-25培養瓶中,將培養瓶置于37℃的二氧化碳培養箱中培養。
8.視細胞貼壁情況48-72h后換液去除未貼壁的細胞,之后繼續培養,視細胞生長狀況和培養基顏色每2-3d換液一次;待細胞貼壁率達到80-90%后,進行常規傳代擴增操作(角質細胞對胰酶不太敏感,消化時間可能會增加到10-15分鐘,有時需要配合使用無菌細胞刮鏟進行傳代)。
 
除了上述的細胞分離方法以外,鏡像綺點還有很多關于其他細胞的分離方法,想要學習的小伙伴可以來鏡像綺點進行現場學習,如果想要其他原代分離培養方法,可在購買相應的細胞過程中,贈送該細胞的分離方法及培養條件,想要了解更多,打電話或咨詢相關工作人員。

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