摘要

   血管性認知功能障礙（Vascular Cognitive Impairment，VCI)是di二大常見 的認知功能障礙，約占所有癡呆的20%，其中，腦白質(zhì)損傷，即髓鞘或少突膠質(zhì)細胞 (Oligodendrocytes，OLs)損傷是VCI重要的病理改變。近年來中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥細 胞棗小膠質(zhì)細胞激活與白質(zhì)損傷的關(guān)系備受關(guān)注。我們前期在VCI動物模型中發(fā) 現(xiàn)，VCI小鼠髓鞘受損、小膠質(zhì)細胞大量激活。同時，缺血引起小膠質(zhì)細胞 Fractalkine/CX3CR1通路激活、CX3CR1表達上調(diào)，其下游核轉(zhuǎn)錄因子kB-_P50/65 (Nuclear Factor- Kappa B, NF-kB)表達升高使小膠質(zhì)細胞釋放更多促炎因子，并導(dǎo) 致認知功能障礙。因此我們提出通過調(diào)控CX3CR1相關(guān)信號通路調(diào)控小膠質(zhì)細胞激 活、減輕炎癥反應(yīng)，從而保護OLs、促進少突膠質(zhì)細胞前體細胞（Oligodendrocyte Prescusor Cells, OPCs)成熟分化修復(fù)髓鞘并改善VCI認知功能。

   本課題米用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎（Bilateral Common Carotid Artery Occlusion， BCCAO)術(shù)構(gòu)建VCI模型，分別對CX3CR1及其通路下游關(guān)鍵因子NF-kB與非受 體型酪氨酸蛋白激酶Src進行拮抗。通過懸尾不動實驗（Tail Suspension Test，TST) 與強迫游泳實驗（Forced Swimming Test，FST)觀察藥物抗抑郁作用；Morris水迷宮 (Morris Water Maze，MWM)觀察動物海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能改善情況。采用酶聯(lián) 免疫吸附法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)檢測外周血清中炎癥因子 與髓鞘相關(guān)蛋白含量，堅牢藍（Luxol Fast Blue，LFB)染色以及免疫組織化學(xué)染色 標記髓鞘堿性蛋白(Myelin Basic Protein，MBP)分別觀察胼胝體（Corpus Callosum, CC) 與海馬區(qū)髓鞘損傷與修復(fù)情況，免疫組織化學(xué)法標記離子鈣接頭蛋白抗原（Ionized Calcium Binding Adapter Molecule 1，Iba-1)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞抗原（Neuron-glial Antigen 2，NG2)、04與神經(jīng)元核抗原（Neuronal Nuclei, Neun)觀察海馬激活小膠質(zhì)細胞、 OPCs、成熟前OLs與神經(jīng)元數(shù)量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western Blot, WB)法對海 馬區(qū)MBP含量進行檢測。

   第yi部分研究表明，CX3CR1中和抗體anti-FKR干預(yù)后，VCI小鼠TST與FST不動時間明顯縮短；MWM隱蔽站臺實驗第4天找到站臺潛伏期時間明顯縮短，空間 探索實驗穿越目標象限的次數(shù)、在目標象限停留的時間以及在目標象限游動的路程占 總游動路程百分比均較VCI+NS組明顯增加，提示拮抗CX3CR1明顯改善VCI小鼠 抑郁行為與海馬相關(guān)學(xué)習(xí)記憶功能。CC區(qū)LFB與免疫組織化學(xué)MBP染色相應(yīng)IOD 值差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義，而海馬區(qū)免疫組化MBP染色以及WB分析MBP相應(yīng)IOD 值明顯升高，外周血清MOG含量下降，提示拮抗CX3CR1能保護海馬區(qū)髓鞘并促進 髓鞘修復(fù)。拮抗CX3CR1后，海馬區(qū)Iba-1陽性細胞數(shù)目明顯減少，同時ELISA結(jié) 果顯示VCI+anti-FKR組IL-ip與TNF-a含量較VCI+NS組明顯降低，表明拮抗CX3CR1能抑制小膠質(zhì)細胞激活并減輕VCI小鼠炎癥反應(yīng)。此外，anti-FKR稍減少 海馬區(qū)NG2陽性細胞數(shù)并明顯增加04與Nerni陽性細胞數(shù)，提示拮抗CX3CR1能促 進海馬區(qū)OPCs成熟分化、修復(fù)受損髓鞘，并保護神經(jīng)元。

    第二部分研究表明，NF-kB拮抗劑PDTC干預(yù)后，VCI小鼠TST與FST不動時 間明顯縮短，而Src拮抗劑PP2上述作用并不明顯。VCI+PDTC小鼠MWM隱蔽站 臺實驗第4天找到站臺潛伏期、空間探索實驗游動速度、穿越平臺次數(shù)、在平臺象限 停留時間、路程差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義，而VCI+PP2小鼠在隱蔽站臺實驗找到站 臺潛伏期時間明顯縮短，空間探索實驗穿越目標象限的次數(shù)與在目標象限游動的路 程占總游動路程百分比均較VCI+NS組明顯增加。拮抗NF-kB與Src蛋白后，CC區(qū) LFB與MBP染色相應(yīng):[OD值比較結(jié)果顯示差異均不具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用PP2能 明顯增加海馬區(qū)MBP免疫組織化學(xué)染色IOD值，并減少外周血中MOG含量，提示 拮抗Src能保護海馬區(qū)髓鞘并促進修復(fù)。與VCI+NS組相比，PDTC+NS組小鼠海馬 區(qū)Iba-1陽性細胞數(shù)明顯減少，血清ELISA中IL-6、TNF-a、HMGB1含量明顯降低， 提示拮抗NF-kB能抑制內(nèi)源性小膠質(zhì)細胞激活并減輕炎癥反應(yīng)。與VCI+NS組相比， PP2+NS組小鼠海馬區(qū)04陽性細胞數(shù)明顯增加、NG2陽性細胞數(shù)稍有減少而Iba-1 與Neun陽性細胞數(shù)沒有明顯差異。提示拮抗Src能促進海馬區(qū)OPCs成熟分化修復(fù) 髓鞘。

上述實驗結(jié)果表明，CX3CR1中和抗體anti-FKR通過抑制CX3CR1通路能有效

   抑制VCI小鼠小膠質(zhì)細胞激活并控制炎癥反應(yīng)、保護海馬區(qū)神經(jīng)元、促進海馬區(qū)OPCs 成熟分化并修復(fù)髓鞘，從而改善缺血小鼠認知功能障礙。NF-kB抑制劑PDTC能減 少VCI動物在缺血缺氧時引起的小膠質(zhì)細胞激活、緩解炎癥，而Src抑制劑PP2能 減少VCI小鼠缺血缺氧時髓鞘的損傷并促進OPCs成熟分化、髓鞘修復(fù)，從而分別改 善VCI小鼠的抑郁與認知功能障礙。因此，調(diào)控CX3CR1下游的Src和域NF-kB的 作用可能是未來預(yù)防與治療VCI潛在的重要靶點。

關(guān)鍵詞_：血管性認知功能障礙，髓鞘，少突膠質(zhì)細胞，小膠質(zhì)細胞， Fractalkine/CX3CR1 通路