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貓杯狀病毒探針法熒光定量 RT-PCR 試劑盒說明書

來源:上海雅吉生物科技有限公司   2021年06月30日 14:21  

貓杯狀病毒(Feline CalicivirusFCV)是一種 RNA 病毒,會引起貓杯狀病毒感染,是一種貓病毒性呼吸道傳染病,主要表現(xiàn)為上呼吸道癥狀,即精神沉郁漿液性和粘液性鼻漏、結(jié)膜炎、口腔炎、氣管炎、支氣管炎,伴有雙相熱。貓杯狀病毒感染是貓的多發(fā)病,發(fā)病率高,死亡率低,因此貓杯狀病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 RT-PCR 術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測貓杯狀病毒的試劑盒,它具有下列特點:

1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 RNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。

3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高,引物是根據(jù)貓杯狀病毒高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他病毒的 RNA

發(fā)生交叉反應。

5. 本產(chǎn)品足夠 50  20μL 體系的探針法熒光定量 RT-PCR 反應。

本產(chǎn)品只能用于科研。

 

成分

編號

十孔盒包裝

探針法 qRT-PCR 緩沖液

190504a

500μL藍蓋

探針法 qRT-PCR 酶混合液

190504b

100μL(紅蓋)

熒光PCR 專用模板稀釋液

180701

1 mL(黃蓋

貓杯狀病毒探針法 qRT-PCR 引物混合液

15-79500yw

100 μL(白蓋)

貓杯狀病毒 qRT-PCR 探針

15-79500pb

50 μL(棕色管

貓杯狀病毒探針法 qRT-PCR 陽性對照(1×10E8 拷貝/μL)

60908-79500pc

50 μL黃蓋

使用手冊

15-79500sc

1 份

 

 

一、稀釋標準曲線樣品 10E2-10E7 拷貝/μL  6  10 倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能

污染他成產(chǎn)穩(wěn)定性病原 本產(chǎn)陽性染性 DNA 性對照1. 標記 6  7,6,5,4,3,2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 RT-PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同

 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震

蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 RNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性
對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 RNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 RNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的柱式病毒 RNAout。
三、Probe qRT-PCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):

  • 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值,再推算出其濃度。
  • 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,如果小于 35,則為陽性。

 

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