藥物傳遞系統DDS:是將脂質體、微囊、微球、微乳、納米囊、納米球、外泌體等作為藥物載體將藥物通過不同的給藥方式,直接輸送到病灶部位的一種新型醫療方式。
將藥物加載到外泌體
在進行藥物傳遞系統DDS設計時,其中一個重要的環節就是載藥方法。由于外泌體具有生物相容性、穩定性和腫瘤靶向性,隨著外泌體技術研究的不斷發展 使它們成為有前景的藥物載體。外泌體的構建類似于雙膜脂質體,并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統DDS設計前需要根據藥物和外泌體特性仔細選擇。
外泌體可以通過被動或主動方法裝載多種藥物、大分子和其他物質( 圖 3)。被動方法比較簡單,它是基于藥物與外泌體或細胞孵育,并進一步分離含有藥物的釋放外泌體( 圖 3 I、II)。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實現;因此,在與外泌體孵育期間,物質本身也 會遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強,例如搖動或攪拌等.
被動裝載法的缺點是裝載效率低,輸出藥物濃度低(約 1%)。將藥物與外泌體或其他 DDS 載體一起孵育是一種較常見并 且簡單的方法,尤其適用于疏水性藥物。
主動加載方法可以實現更高的加載效率,包括超聲處理 (可達~28%)、電穿孔 (~5%) 、擠壓、凍融、pH 梯度 (1.7%) 和結合方法。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在 外泌體膜上穿孔,再分別由聲波或電脈沖介導( 圖 3 III、IV)。之后,外泌體將通過上述試劑誘導的小膜孔從溶液中加載藥物。這些方法似乎不會改變外泌體膜的特性,但會導致外泌體大小增加。
主動加載法的另一種方法是通過抗體或點擊化學將藥物與外泌體結合。抗體將通過它們對外泌體結構元素的親和力非共價結合到外泌體表面( 圖 3七). 化學合成將導致藥物通過例如 PEG 或膜蛋白與外泌體共價結合,并且進一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細胞 。
圖 3. 將藥物裝入外泌體的方法。
( I )—從藥物暴露細胞中釋放的載藥外泌體,
( II )— 藥物與外泌體孵育并攪拌,
( III )—超聲處理,
( IV )—電穿孔,
( V )— 擠出,
( VI )—凍融循環,
( VII )-藥物與外泌體的化學綴合。
以上步驟中提到的方法允許根據藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內部。親水性物質將滲透于外泌體的腔內,而可溶于脂質的物質將聚集在外泌體的膜上( 圖2)。一些研究報告證明,親水性物質很容易加載到外泌體中,而親脂性物質的加載效率較低。通常,這些物質在體外 24 小時內從外泌體釋放約 50% 。
選擇藥物加載方法時需要考慮到對外泌體結構和特性的影響。目前,通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍。
實際上,外泌體作為細胞間信號傳遞分子可以遞送多種物質,包括化療藥物(紫杉醇、多柔比星和紫杉醇)、RNA 和 DNA等 。另外,近年來還針對細菌(弓形蟲病和沙門氏菌病)、病毒(艾滋病和乙型肝炎)、癌癥(肺癌、胰腺癌、結腸癌、腦癌和乳腺癌)等進行基于外泌體的疫苗開發設計。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具 ,例如 Cas9.
給藥途徑
根據目前的研究,外泌體主要通過靜脈內給藥,位置主要為肝臟肺和腦、胃中,只有少數研究使用另一種給藥方法,即經鼻、口服和腹膜內給藥。
表 4. 外泌體的藥物、大分子和潛在靶向策略示例。
近些年,外泌體研究領域發展迅速,來新型外泌體分離技術實現了從小體積樣品中快速、高效、精確地分離,在外泌體研究也取得了許多重大進展,這些都使外泌體成為納米藥物、基因要等創新藥的遞送工具。外泌體技術的發展 對于未來的外泌體的檢測、生物標志物篩選以及癌癥的鑒別等也都具有重要的意義。
選擇外泌體作為給藥載體的主要優勢在于它可以降低藥物濃度,能夠準確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用。盡管如此,外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如:在外泌體研究領域中,由于不同供體細胞分離的外泌體特性也是不同的,需要足夠了解與熟悉各種外泌體的 特性,了解外泌體的長期毒性、免疫原性和安全性這也是外泌體藥物傳遞系統DDS設計的重點。
蘇州阿爾法生物專注于生物實驗室儀器和生物試劑、實驗室耗材行業14年。所提供的納米粒度儀、熒光顯微鏡等廣泛應用于細胞外泌體研究領域。另外,提供的實驗室設備包括發酵罐、生物反應器、細胞培養搖床、恒溫恒濕培養箱、PCR儀、乳酸分析測定儀等也廣泛應用于生命科學實驗。
將藥物加載到外泌體
在進行藥物傳遞系統DDS設計時,其中一個重要的環節就是載藥方法。由于外泌體具有生物相容性、穩定性和腫瘤靶向性,隨著外泌體技術研究的不斷發展 使它們成為有前景的藥物載體。外泌體的構建類似于雙膜脂質體,并且藥物裝載方法也類似。但在藥物傳遞系統DDS設計前需要根據藥物和外泌體特性仔細選擇。
外泌體可以通過被動或主動方法裝載多種藥物、大分子和其他物質( 圖 3)。被動方法比較簡單,它是基于藥物與外泌體或細胞孵育,并進一步分離含有藥物的釋放外泌體( 圖 3 I、II)。這種方法通過不同的藥物濃度梯度來實現;因此,在與外泌體孵育期間,物質本身也 會遷移到囊泡中。這一過程可以通過施加額外的力來加強,例如搖動或攪拌等.
被動裝載法的缺點是裝載效率低,輸出藥物濃度低(約 1%)。將藥物與外泌體或其他 DDS 載體一起孵育是一種較常見并 且簡單的方法,尤其適用于疏水性藥物。
主動加載方法可以實現更高的加載效率,包括超聲處理 (可達~28%)、電穿孔 (~5%) 、擠壓、凍融、pH 梯度 (1.7%) 和結合方法。具體方法是通過超聲處理和電穿孔在 外泌體膜上穿孔,再分別由聲波或電脈沖介導( 圖 3 III、IV)。之后,外泌體將通過上述試劑誘導的小膜孔從溶液中加載藥物。這些方法似乎不會改變外泌體膜的特性,但會導致外泌體大小增加。
主動加載法的另一種方法是通過抗體或點擊化學將藥物與外泌體結合。抗體將通過它們對外泌體結構元素的親和力非共價結合到外泌體表面( 圖 3七). 化學合成將導致藥物通過例如 PEG 或膜蛋白與外泌體共價結合,并且進一步釋放取決于外泌體降解。這些方法還可以通過將特定受體引入膜來將外泌體靶向所需細胞 。
圖 3. 將藥物裝入外泌體的方法。
( I )—從藥物暴露細胞中釋放的載藥外泌體,
( II )— 藥物與外泌體孵育并攪拌,
( III )—超聲處理,
( IV )—電穿孔,
( V )— 擠出,
( VI )—凍融循環,
( VII )-藥物與外泌體的化學綴合。
以上步驟中提到的方法允許根據藥物的親水性和親脂性將藥物摻入外泌體或磷脂雙層的內部。親水性物質將滲透于外泌體的腔內,而可溶于脂質的物質將聚集在外泌體的膜上( 圖2)。一些研究報告證明,親水性物質很容易加載到外泌體中,而親脂性物質的加載效率較低。通常,這些物質在體外 24 小時內從外泌體釋放約 50% 。
選擇藥物加載方法時需要考慮到對外泌體結構和特性的影響。目前,通過電穿孔的聚集和融合法使用較為普遍。
實際上,外泌體作為細胞間信號傳遞分子可以遞送多種物質,包括化療藥物(紫杉醇、多柔比星和紫杉醇)、RNA 和 DNA等 。另外,近年來還針對細菌(弓形蟲病和沙門氏菌病)、病毒(艾滋病和乙型肝炎)、癌癥(肺癌、胰腺癌、結腸癌、腦癌和乳腺癌)等進行基于外泌體的疫苗開發設計。所以外泌體也常被用作基因編輯工具遞送的工具 ,例如 Cas9.
給藥途徑
根據目前的研究,外泌體主要通過靜脈內給藥,位置主要為肝臟肺和腦、胃中,只有少數研究使用另一種給藥方法,即經鼻、口服和腹膜內給藥。
表 4. 外泌體的藥物、大分子和潛在靶向策略示例。
外泌體的藥物方法和給藥途徑 | ||||
藥物/大分子 | 加載效率和方法 | 起源 | 靶向細胞/組織 | 影響 |
紫杉醇 | 1.4%;逆轉錄孵育;5.3%;電穿孔;28.3%;輕度超聲處理 | RAW 264.7 細胞系 | Madin–Darby 犬腎 MDCK WT和 MDCK MDR1細胞,小鼠 Lewis 肺癌細胞亞系 (3LL-M27) | 多重耐藥細胞系的細胞毒性增加超過 50 倍。 |
阿霉素 | 7.4%;超聲處理和隨后的擠壓 | 4T1細胞系 | MCF-7細胞系 | 近紅外激光觸發的多柔比星從用 Fe 3 O 4修飾的外泌體中釋放。 |
阿霉素 | 6.5%;超聲處理 | 雄性 KM 小鼠的小鼠骨髓 | 斑馬魚,攜帶 C6-Luc 神經膠質瘤的小鼠 | 快速血腦屏障穿越和腦積聚。靶向:浸潤性腦腫瘤細胞。 |
hsa-miR148a-3p | 無損檢測;化學轉染(Lipofectamine 2000) | 牛奶 | HepG2、Caco-2細胞系 | 具有成本效益的外泌體來源。時間依賴性細胞摻入。 |
紫杉醇 | 8%;逆轉錄孵育 | 牛奶 | 裸鼠肺腫瘤異種移植 | 腫瘤生長抑制。與靜脈內給藥相比,全身和免疫原性毒性較低 |
紫杉醇 | 14%;藥物孵育細胞 | 來自臍帶的 MSC | A549、SK-OV-3、MDA-hyb1細胞系;NODscid 小鼠的 MDA-hyb1 乳腺腫瘤 | 與含有紫杉醇的外泌體相比,使用高 1000 倍濃度的游離紫杉醇可減少癌癥的生長和轉移。 |
埃拉斯汀 | 3.2 毫克 erastin/毫克蛋白質;超聲處理 | HFL-1細胞系 | MDA-MB-231細胞系 | 用于靶向遞送、促進鐵死亡、減少增殖和癌細胞遷移的葉酸標記外泌體。 |
CRISPR/Cas9 質粒 DNA | 來自 MSC 的外泌體的化學轉染(Exo-Fect™ 外泌體轉染試劑盒); | KPC689 | 成功破壞胰腺癌細胞中的Kras G12D致癌等位基因。抑制增殖和腫瘤生長 | |
CRISPR/Cas9 質粒 DNA | 細胞 (HEK293T) 的化學轉染 (Lipofectamine 2000) 和從條件培養基中分離外泌體 | HEK293T細胞系 | 細胞系 | |
PEI 基質中靶向 KRAS 的 siRNA; | >90%;與 PEI 基質孵育; | 牛初乳 | H1299、A549、H522、Panc-1、MiaPaCa-2細胞系;體內 A549 異種移植模型 | 抑制腫瘤生長和 KRAS表達。在 p53-null H1299 細胞中誘導 p53 的表達。 |
編碼 p53 的質粒 DNA | <5%;電穿孔; | |||
35% 用 Exo-Fect™ 進行化學轉染(約 35%) | ||||
阿霉素; 膽固醇修飾的 miRNA159 | 74.5–160.6 ng/μg 外泌體;在三乙胺溶液中孵育;1.2% 的 miRNA,5.3% 的膽固醇修飾的 miRNA | THP-1細胞系 | MDA-MB-231細胞系 | 外泌體的靶向特性,對癌細胞的協同治療作用,抑制生長和運動。TCF-7 基因的沉默。 |
5-氟尿嘧啶;miR-21抑制劑寡核苷酸 | 3.1%;0.5%;電穿孔 | 293T細胞系 | HCT-116 SFR細胞系;體內 BALB/c 裸鼠 | 成功共遞送、細胞中 miR-21 的下調、周期停滯的誘導、增殖減少、耐藥性逆轉、5-FU 細胞毒性增加、體內腫瘤生長減少 |
miR-31-5p | 不適用;電穿孔 | 牛奶 | HUVEC細胞系;體內 BALB/c 小鼠 | 體外細胞功能改善,血管生成增強,糖尿病小鼠體內傷口愈合 |
CD47 和 SIRPα 抗體 | 通過 pH 敏感接頭與外泌體表面綴合 | RAW264.7細胞系 | RAW264.7細胞系,體內BALB/C小鼠 | 靶向 CD47 表達細胞,改善巨噬細胞吞噬作用,外泌體重編程巨噬細胞抗癌活性 |
galectin-9 siRNA,奧沙利鉑 | 半乳糖凝集素9、13.17% 馬來酰亞胺-硫醇偶聯物的 13.17% N/A 電穿孔 | 骨髓間充質干細胞 | PANC-02細胞系,體內C57BL/6小鼠,SD大鼠 | 顯著的抗癌活性,提高巨噬細胞腫瘤抑制活性,增加細胞毒性 T 淋巴細胞的募集 |
小檗堿 | 17.13%,超聲處理 | 原代巨噬細胞 | C57BL/6J小鼠 | 巨噬細胞抗炎和抗凋亡 M2 表型的誘導,脊髓損傷后小鼠運動的改善 |
Erastin、Rose Bengal、CD47 表面標記的外泌體 | 60%、84% 的包封率,超聲處理;CD 47 質粒轉染的供體細胞 | HEK293T細胞系 | RAW264.7 Hepa1-6 細胞系,體內 C57BL/6 | 阻止外泌體吞噬作用,激光照射后體內和體外鐵死亡誘導,外泌體肝腎細胞毒性降低 |
miR-138-5p | 慢病毒轉染供體細胞 | 脂肪來源的干細胞 | T24,5637細胞系,體內BALB/C裸鼠 | 膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲減少,抑制體內腫瘤生長 |
選擇外泌體作為給藥載體的主要優勢在于它可以降低藥物濃度,能夠準確到病灶部位有效提高效率并減少藥物的毒副作用。盡管如此,外泌體的載藥效率仍有提升空間。比如:在外泌體研究領域中,由于不同供體細胞分離的外泌體特性也是不同的,需要足夠了解與熟悉各種外泌體的 特性,了解外泌體的長期毒性、免疫原性和安全性這也是外泌體藥物傳遞系統DDS設計的重點。
蘇州阿爾法生物專注于生物實驗室儀器和生物試劑、實驗室耗材行業14年。所提供的納米粒度儀、熒光顯微鏡等廣泛應用于細胞外泌體研究領域。另外,提供的實驗室設備包括發酵罐、生物反應器、細胞培養搖床、恒溫恒濕培養箱、PCR儀、乳酸分析測定儀等也廣泛應用于生命科學實驗。
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