細胞培養(yǎng)技術意義及應用

細胞培養(yǎng)（cell culture）是指在體外模擬體內環(huán)境（無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等），使之生存、生長、繁殖并維持主要結構和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫細胞克隆技術，在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術。

細胞培養(yǎng)技術是細胞生物學研究方法中重要和常用技術，通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞，又可以借此研究細胞的信號轉導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。細胞培養(yǎng)技術在整個生物技術產(chǎn)業(yè)的發(fā)展中起核心作用，現(xiàn)代的生物技術一般包括基因工程技術、細胞工程技術、酶工程技術和發(fā)酵工程技術，這些技術的發(fā)展幾乎都與細胞培養(yǎng)密切相關。

細胞培養(yǎng)技術的應用領域

01、基礎研究

如藥物作用機理、基因功能、疾病發(fā)生機理等研究

02、藥物研究開發(fā)

如新藥篩選、疫苗、基因工程藥物，細胞工程藥物，研究與開發(fā)，單克隆抗體制備等

03、疫苗生產(chǎn)

如病毒性疫苗（肝炎病毒疫苗、艾滋病疫苗等）、多肽疫苗（腫瘤疫苗）等

04、基因工程藥物生產(chǎn)

如EPO等，抗體藥物、基因治療藥物生產(chǎn)

05、細胞工程藥物生產(chǎn)

生物細胞內的一些生物活性多肽、生物活性物質，如蛋白質等，預測其在體內的藥效和替代體內法檢測其成品的生物活性

HEK293懸浮培養(yǎng)，力康設備解決方案為參考

今天，采用力康相關設備的解決方案作為參考，以“二氧化碳恒溫振蕩器中進行HEK293懸浮培養(yǎng)的實驗流程”為例，小編為大家奉上一篇干貨滿滿的細胞培養(yǎng)知識盛宴。

此類哺乳動物細胞在培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基成本較高、生長條件較為復雜、生長周期較長、對剪切力和培養(yǎng)環(huán)境較為敏感，是較為典型的高要求細胞培養(yǎng)案例。

細胞培養(yǎng)可分為動物細胞培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng)、微生物細胞培養(yǎng)，其中，最困難的是動物細胞培養(yǎng)。動物細胞培養(yǎng)所要求的體外培養(yǎng)環(huán)境及培養(yǎng)條件較高，因此，對實驗室設備的要求也較高。

用于細胞培養(yǎng)的相關設備很多，比如：生物安全柜、超凈工作臺、高速冷凍離心機、醫(yī)用低溫保存箱、二氧化碳培養(yǎng)箱、二氧化碳恒溫振蕩器、生物反應器、超純水系統(tǒng)等，這些設備的品質在某種程度上決定了細胞培養(yǎng)的效果。

實驗流程（僅供參考）

一、細胞馴化

（1）直接馴化：大部分情況下，培養(yǎng)于原培養(yǎng)基中的細胞，可以直接適應目標培養(yǎng)基，只要按照日常傳代方式（稀釋）更換培養(yǎng)基即可。

1、原培養(yǎng)基中的細胞，直接稀釋傳代到目標培養(yǎng)基中，細胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

2、將細胞置于37℃，5%CO2，轉速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)

3、4~6天后對細胞培養(yǎng)液進行稀釋（或者離心800rpm，3~5min更換上清），保持稀釋（或者離心）后細胞密度為0.3~0.4×106cells/ml

4、經(jīng)過在100%的目標培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后4~6天細胞的密度可以達到2~3×106cells/ml，細胞活率＞90%。這說明細胞已經(jīng)適應了目標培養(yǎng)基，之后進行細胞的傳代培養(yǎng)時，細胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml左右

（2）漸進式馴化：注意：選用低代次，處于對數(shù)生長期的細胞進行馴化。

1、原培養(yǎng)基中復蘇細胞并繼續(xù)使用該培養(yǎng)基傳代2~3次至細胞生長穩(wěn)定，當細胞密度達到2~3×106cells/ml后進行傳代，傳代后細胞密度控制在0.5~0.6×106cells/ml，5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標培養(yǎng)基的比例為75:25

2、將細胞置于37℃，5%CO2，轉速為110~175rpm的恒溫搖床中進行培養(yǎng)

3、當細胞密度3~4天后達到3×106cells/ml且細胞活率>90%，傳代時5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標培養(yǎng)基的比例為 50:50,細胞密度控制0.5~0.6×106cells/ml

注：如細胞生長慢，可離心上清，留20%培養(yǎng)基，加入80%的5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標培養(yǎng)基比例為75:25的混合培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)；再下次傳代時重復步驟③

4、重復步驟③逐步增加目標培養(yǎng)基所占的比例（5~10%血清的傳統(tǒng)培養(yǎng)基或原無血清培養(yǎng)基與目標培養(yǎng)基的比例為25:75至10:90）直到100%的目標培養(yǎng)基

5、經(jīng)過在100%的目標培養(yǎng)基中的幾次傳代培養(yǎng)，傳代后3~4天細胞的密度可以達到2~3×106cells/ml，細胞活率＞90%，這說明細胞已經(jīng)適應了目標培養(yǎng)基。之后進行細胞的傳代培養(yǎng)時，細胞的起始密度可以降到0.2~0.3×106cells/ml，一般傳代2~3次后再進行轉染實驗。注意：一般細胞馴化過程中，前三代細胞的狀態(tài)可能不是很好，但一般從第四代狀態(tài)會有改善

二、細胞復蘇

1、迅速取出凍存的細胞，在37℃水浴條件下進行解凍（可以將離心管在水中輕輕晃動，時間控 制在60s以內）

2、輕輕地混勻細胞并將融化的細胞全部移至 15ml（或 50ml）無菌離心管中（用培養(yǎng)基沖洗幾次凍存管），逐滴加入5~8ml預熱到37℃的目標培養(yǎng)基

3、離心換液（800rpm，3~5min）去除全部上清，加入預熱新鮮目標培養(yǎng)基重懸，轉移至125ml搖瓶內（用培養(yǎng)基沖洗幾次離心管），最終達到25~40ml，使得細胞密度達到0.4~0.6×106cells/ml

4、將細胞置于37℃，5%CO2，轉速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)

5、2~3天后通過人工或儀器測定細胞的密度及活率，若細胞密度達到2.0×106cells/ml，活率達到85%以上則可進行傳代培養(yǎng)

6、如果細胞密度低于1.0×106cells/ml，則建議對細胞進行離心（800rpm，5min），然后重懸于20~30ml的新鮮培養(yǎng)基中使得細胞密度為0.4~0.6×106cells/ml左右，并繼續(xù)培養(yǎng)至細胞正常生長則可進行傳代培養(yǎng)

三、細胞傳代

1、取細胞培養(yǎng)樣品，人工或儀器測定細胞密度以及活率

2、原培養(yǎng)基中的細胞，直接稀釋傳代到目標培養(yǎng)基中，細胞密度控制在0.3~0.4×106cells/ml

3、恢復活力的標準：活率＞95%，細胞形態(tài)規(guī)則圓整，生長倍增時間正常

4、將細胞置于37℃，5%CO2，轉速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)，2~3天傳代一次

四、細胞轉染

細胞轉染在目標培養(yǎng)基中，采用商業(yè)化轉染試劑（例如Gibco293Fectin™、ExpiFectamine™293、TransfectionKit）或PEI（線性化聚乙酰亞胺），可以實現(xiàn)對 HEK293 細胞的高效轉染，具體操作可參考所購買轉染試劑盒的說明書進行實驗。

1、轉染前一天按照2.0×106cells/ml密度接種，培養(yǎng)第二天細胞密度可至4.0×106cells/ml左右

2、培養(yǎng)第二天，細胞計數(shù)后，細胞活率＞95%，活細胞密度≥4.0×106cells/ml，可直接使用；若細胞密度低于4.0×106cells/ml，可通過離心（800rpm，3~5min）收集細胞，將細胞以 4.0×106cells/ml密度重懸于目標培養(yǎng)基中 注：如果后期進行≥6天的瞬轉表達同時不添加補料和葡萄糖，建議瞬轉時密度控制在 2.0~3.0×106cells/ml

3、按照優(yōu)化后的瞬轉工藝，以20ml體系單抗使用PEI轉染為例，制備DNA和PEI混合液

①配制A、B液，渦旋混勻后室溫靜止5min

②A：20ug質粒+600ul（培養(yǎng)基或PBS）

③B：80ugPEI+600ul（培養(yǎng)基或PBS），進行0.22um抽濾

④將A液加入到B液中輕輕吹打混勻，室溫靜置15min

4、將混合液加入到培養(yǎng)液中，進行培養(yǎng)

5、大于6天的培養(yǎng)時間，建議在20小時后加≤5%補料（也可再額外加入＜5g/l葡萄糖）加入培養(yǎng)基，可進一步提高活細胞密度和蛋白表達量。如果條件允許，可以檢測殘?zhí)牵刂茪執(zhí)菨舛仍?~6g/l，效果更佳

6、培養(yǎng)至活力低于60%，結束培養(yǎng)。此步驟可以直接轉染質粒進行表達，也可得到腺病毒（lentivirus表達系統(tǒng)）再進行病毒感染表達蛋白

五、細胞感染

1、按一定比例混合病毒和293細胞，進行感染

2、將細胞放置在37℃溫度，5%CO2濃度，轉速為110~175rpm的二氧化碳恒溫振蕩器中進行培養(yǎng)

六、細胞凍存

1、凍存細胞時，要選擇處于對數(shù)生長期同期細胞在90%以上的細胞活率，一般建議凍存密度為 5~10×106cells/ml

2、事先計算好凍存的細胞管數(shù)和所用的培養(yǎng)基的體積

3、制備細胞凍存液：90%目標培養(yǎng)基+10%DMSO混合液存放在4℃，一般為當天用當天制備

4、對細胞樣品進行計數(shù)

5、以800rpm，3~5min的條件離心收集細胞，然后用凍存培養(yǎng)基（4℃）重懸細胞

6、取樣計數(shù)，調整細胞密度，使得細胞密度為 5~10×106cells/ml，迅速分裝細胞到無菌的凍存管中，一般2ml的凍存管加入1~1.5ml細胞懸液，貼好標簽，密封

7、將細胞凍存管放到程序降溫凍存盒（注意填充異丙醇，4℃預冷）中，置于-80℃冰箱（每分鐘下降1℃），過夜存放后將細胞轉入液氮罐中進行保存。（注意：降溫一定需要梯度降溫：可4℃1h、-20℃2~4h，-80℃過夜，最后放入液氮長期儲存。）

細胞培養(yǎng)技術，力康實驗室相關設備

Smart Plus 超純水系統(tǒng)

在上述實驗流程中，細胞培養(yǎng)基干粉調制制備、細胞馴化過程中細胞培養(yǎng)液的稀釋、細胞轉染過程中轉染試劑的制備等步驟，均需使用純水或超純水，在實驗過程中經(jīng)常被忽略的蒸發(fā)盤、水庫、水盤，用來維持培養(yǎng)環(huán)境中的濕度，如果使用的純水或超純水不達標或蒸發(fā)盤、水庫、水盤長期沒有清洗，水中的雜質可能會擴散到培養(yǎng)環(huán)境中，從而影響細胞培養(yǎng)的結果。所以，實驗室純水和超純水系統(tǒng)的選擇尤為重要。

力康Smart Plus超純水系統(tǒng)為您的實驗提供滿足《GB/T 33087-2016 儀器分析用高純水規(guī)格及試驗方法》、《GB/T 6682-2008 分析實驗室用水規(guī)格和實驗方法》、《GB/T 11446電子級超純水中國國家標準》等標準的純水或超純水，助力您的實驗研究取得圓滿成功。

高速冷凍離心機

在上述實驗流程中，細胞馴化、復蘇、轉染、凍存、細胞培養(yǎng)液的離心，均需使用高速冷凍離心機。如果細胞培養(yǎng)實驗的目的是產(chǎn)物表達，那么對溫度敏感性的產(chǎn)物，例如在低溫條件下才能保持活性的蛋白質，離心過程中必須使用冷凍離心機，從而保障在實驗步驟中，維持產(chǎn)物的活性，獲得良好的實驗結果。

力康高速冷凍離心機，為您提供穩(wěn)定的運行工況、智能升降溫控制、智能轉子識別技術、電子式平衡裝置，可滿足細胞培養(yǎng)的實驗需求。其出色的產(chǎn)品功能為您節(jié)省寶貴的時間，保護您珍貴的實驗樣品，助您盡快獲得研究成果。

醫(yī)用低溫保存箱

在上述實驗流程中，在細胞凍存過程中，需使用醫(yī)用低溫保存箱，保存箱的穩(wěn)定性較為重要，如果出現(xiàn)局部失溫或溫度異常，以及凍存操作不標準或系統(tǒng)故障，珍貴的細胞種子樣本極有可能失活。

力康低溫冷鏈產(chǎn)品涵蓋2-8℃冷藏保存箱、-25℃低溫保存箱、-40℃低溫保存箱和-86℃低溫保存箱，擁有多種容積規(guī)格可選，雙機復疊制冷，智能觸屏操作、可選雙獨立系統(tǒng)主機、多重報警系統(tǒng)、采用第二代VIP技術、采用*低噪音技術等特點，產(chǎn)品可用于保存病毒、細菌樣本、疫苗、生物組織及器官特殊食品、藥品、材料等，為您的實驗室研究提供穩(wěn)定、理想的儲存環(huán)境。

力康集團深耕醫(yī)療器械和生命科學領域三十余年，專注于提供多樣化、多場景的臨床醫(yī)療和實驗室整體解決方案，包括智慧數(shù)字一體化手術室、數(shù)字化麻醉重癥、數(shù)字化實驗室、數(shù)字化新生兒科、數(shù)字化康復中心、數(shù)字化醫(yī)療及實驗室信息管理以及數(shù)字化遠程醫(yī)療整體解決方案等。

未來，力康將繼續(xù)為用戶提供智能化、數(shù)字化、 人性化的實驗室設備，滿足現(xiàn)代實驗室應用需求，提供各類解決方案和專業(yè)化服務。