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李丕  邢江濤

代謝組學旨在對給定生物學背景下的所有代謝物（小分子）進行識別和定量。質譜法是對小分子進行準確分析的最強大工具之一，可以檢測成百上千種代謝物。然而，由于數據庫覆蓋范圍有限及代謝組的復雜性，通常只有不到30%的化合物被鑒定，而未注釋的峰很可能是感興趣化合物。因此未知物識別一直是代謝組學研究中最耗時的步驟，依賴質譜專家對數據進行勞動密集型的手動注釋。

本文將從分辨率和質量精度、同位素過濾、CI確認、靈敏度、動態范圍、解析軟件這6個維度討論GC-Orbitrap/MS在代謝組學中小分子識別和定量的表現。

01

未知物注釋—— HRAM

近十年來隨著 GC-Orbitrap/MS 高分辨氣質系統的興起，整個代謝組進入快速注釋的新時代。這得益于GC-Orbitrap/MS超高分辨率（高達240K）和亞ppm質量精度的優點。采集樣本生成高分辨質譜數據，然后利用離子質量虧損遞推計算出未知峰所有可能的分子式。分辨率是分離兩個m/z相近離子的能力，質量精度是實測值和理論值的偏差。分辨率和質量精度越高，滿足篩選條件的分子式越少，越容易得到正確注釋。

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Misra使用 GC-Orbitrap/MS 分析了標準參考物質 NIST SRM 1950 混合血漿參考樣品，以評估該平臺對常規發現代謝組學在代謝物注釋和定量方面的適用性[1]。該研究分別通過EI、PCI 和 NCI 模式自信地鑒定了 263、93 和 65 種代謝物（代謝組學標準倡議MSI置信水平 2），其中 270 種代謝物 (64%) 使用內部譜庫進行了驗證。另外，與使用相同 NIST SRM 1950 血漿樣品的已發表的基于LC-MS 的工作相比，兩個平臺只有 17% 的代謝物重疊，說明了血漿代謝組學研究中使用GC-Orbitrap/MS 平臺的互補性和必要性。

02

未知物注釋——同位素模式過濾

在高m/z區域，僅靠高質量精度不足以排除足夠多的候選物，因為高m/z區域存在更多化學上可能的分子式。研究表明同位素模式正交過濾可以排除>95%的錯誤候選物。

Qiu使用加標的同位素比率離群值分析 (IROA) 進行未知代謝物注釋[2]，并證明使用該工作流程生成化學式的可靠性更高。本質上，IROA 工作流程使用兩種不同的 13C 富集碳源（隨機 95% 12C 和 95% 13C）以產生鏡像同位素峰對，二者的質量差異揭示了碳鏈長度 (n)，從而有助于鑒定內源性代謝物。通過GC-Orbitrap/MS數據可以識別 244 個 IROA 峰對，平均質量偏差為1.48 ppm，這顯著提高了 IROA 的檢測能力（Qiu 之前的工作使用其他類型的高分辨質譜，僅得到 126 個 IROA 峰對，平均質量偏差為 32.2 ppm）。  

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03

未知物注釋——EI+CI互補

元素組成的計算需要豐富的分子離子。EI譜圖通常分子離子豐度低或缺失，因此需要使用 CI軟電離獲得分子離子信息。很多研究都使用GC-Orbitrap/MS 結合CI電離為顯著失調的未知物生成可能的分子式，此處不贅述。

Misra在其研究論文中對GC-Orbitrap/MS輕松切換EI/CI源的功能給予了中肯評價。他提到，對于我們的高分辨 GC-Orbitrap/MS 儀器，EI 和 CI 之間的切換很容易，一個制備好的樣品可以依次運行 EI-MS、PCI-MS/MS 和 NCI-MS分析。

賽默飛具有獨特的VPI技術，可以在不破壞質譜真空的情況下2分鐘之內切換EI源和CI源，5分鐘內更換色譜柱，消除宕機時間，輕松實現EI/PCI聯合定性或雙柱RI定性。更有EI/CI混合離子源，一個離子源實現三種電離模式。

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04

高靈敏度——小樣本量發現更多標志物

研究表明，GC-Orbitrap/MS在代謝組學中的靈敏度和發現標志物的數量遠遠高于四極桿質譜[3]。若要在兩種儀器得到的響應強度相近的TIC，需要在 四極桿質譜上注入濃度高 8 倍的樣品。以相同參數對數據進行峰拾取、分組、過濾后，分別剩下 114 個（四極桿）和 339 個化合物（GC-Orbitrap/MS）——這是 3 倍的差異。這表明GC-Orbitrap/MS的靈敏度更高，使用更小的樣本量即可增加代謝覆蓋率。

可用樣本量對于環境樣本或可擴展培養的生物體不是問題，但可能是人類或動物研究的限制因素。更重要的是，在樣品濃度降低 8 倍的情況下，GC-Orbitrap/MS 仍檢測生成了幾乎 3 倍的代謝物。

比較兩種儀器中顯著失調的化合物，有趣的是，兩個數據集的重要化合物只有 28% 重疊。在四極桿數據集中發現缺失46個失調化合物，而 GC-Orbitrap/MS 數據集僅缺失9個失調化合物。四極桿缺失的化合物中， 4個由于解卷積錯誤而缺失；12個由于p 值或倍數變化不符合重要化合物的閾值標準而缺失；29個因檢測到的碎片太少缺失。由此可見，GC-Orbitrap/MS 可以檢測到更多的化合物，因為它的檢測限較低。此外，GC-Orbitrap/MS缺失的9種化合物中有2個被排除是因為它們存在于培養基空白中；2個解卷積錯誤缺失，5個因 p 值或倍數變化不符合重要化合物的閾值標準。

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05

動態范圍

代謝組學的一個關鍵挑戰是生物樣品中代謝物濃度的動態范圍較大，跨越4-6 個數量級。對于傳統光電倍增器式質譜檢測器，很容易導致飽和。

GC-Orbitrap/MS是一種新型高分辨質譜儀，動態范圍高達6個數量級。因此GC-Orbitrap/MS允許引入更多的樣品，從而獲得更多的低豐度代謝物。在Qiu的研究中，GC-Orbitrap/MS 具有更寬的動態范圍，因此可以檢測到更多的 IROA 峰對，結合GC-Orbitrap/MS的高分辨率，共同提高了分子式的可靠性。

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呼吸氣檢測可以揭示人體的揮發性代謝組，是疾病早期診斷和精準醫學的有效工具。Boyle采用熱脫附（TD）與 GC-Orbitrap/MS 聯用搭建Breath Biopsy呼吸活檢平臺（Owlstone Medical），將呼吸樣本收集、熱解吸和測量聯系起來，以提供呼吸樣本的綜合概況。GC-Orbitrap/MS 高分辨率質譜儀與呼吸活檢結合使用的主要優勢在于動態范圍寬、質量分辨率高和質量準確度高，可實現低濃度和高濃度下的檢測和定量以及快速可靠的化合物鑒定。同一呼吸樣本中可能含有非常高和超痕量（飛克）水平的化合物，因此獲取廣泛豐度范圍內的高質量數據至關重要。超過6個數量級動態范圍使 GC-Orbitrap/MS 輕松勝任呼吸活檢（見下圖）。

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另外，呼吸分析通常受到樣本數量的限制，因此必須從單一分析中收集定量和定性信息。GC-Orbitrap/MS能夠進行平行的靶向和非靶向分析，從而研究已知和潛在的新型生物標志物。

06

軟件

軟件與儀器本身同樣重要，是成功鑒定化合物的基石之一。質譜硬件當下處于非常先進的階段，結構解析的最終成功在于如何深度利用數據。這就要求開發更好的軟件程序，以及評估HRAM MS數據的復雜工具。

GC-Orbitrap/MS配套賽默飛專業的數據解卷積、大隊列的組學分析、和化合物質譜裂解軟件。

組學分析軟件Compound Discoverer內置高效靶向和非靶向分析工作流，幫助用戶最大化從代謝組學樣本中獲得的代謝覆蓋率和未知物質注釋方面的信息，并可進行分子網絡、代謝通路分析。

質譜裂解軟件Mass Frontier包含3萬多個裂解方案，其中包含十余萬個反應和相關結構。可以執行直接分子搜索、子結構搜索、相似性搜索和名稱搜索，并且所有關聯的元數據都可以電子方式搜索，可用于開發計算機碎片預測。

Mass Frontier質譜裂解軟件一瞥（從手繪到電子檢索預測）（點擊查看大圖）

總結

在代謝組學領域，GC-Orbitrap/MS被積極用于捕獲各種生物學背景的揮發性、非極性和極性（衍生）小分子。短短幾年，大量研究工作使用 GC-Orbitrap/MS生成了令人興奮的高通量和高質量的數據，涵蓋基礎研究到應用研究領域。通過靶向和非靶向工作流程，GC-Orbitrap/MS有望提供高質量的數據集，以應對各種研究挑戰。

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