1．為什么需要新鮮的菌液？

首先，新鮮的菌液易于培養，可以獲得更多的DNA，同時最大限度地保證菌種的純度。

2．如何提供菌液？

如果您提供新鮮菌液，用封口膜封口以免泄漏；也可以將培養好的4～5ml菌液沉淀下來，倒去上清以方便郵寄。同時郵寄時最好用盒子以免郵寄過程中壓破。

3．如何制作穿刺菌？

用滅菌過1.5ml或2ml離心管加入LB瓊脂(7g/L)斜面凝固，用接種針挑取分散良好的單菌落穿過瓊脂直達管底，不完quan蓋緊管蓋適當溫度培養過夜，然后蓋緊蓋子加封口膜，室溫或4度保存。

4． PCR產物直接測序有什么要求？

（1) 擴增產物必須特異性擴增，條帶單一。如果擴增產物中存在非特異性擴增產物，一般難以得到好的測序結果；

(2）必須進行膠回收純化；

(3）DNA純度在1.6—2.0之間，濃度50ng/ul以上。

5．為什么PCR產物直接測序必須進行Agarose膠純化？

如果不進行膠純化而直接用試劑盒回收，經常會導致測序出現雙峰甚至亂峰，這主要是非特異性擴增產物或者原來的PCR引物去除不干凈所導致。

大多所謂的PCR“純化試劑盒”實際上只是回收產物而不能起到純化的作用的。對于非特異性擴增產物肯定無法去除，而且通常他們不能夠完quan去除所有的PCR引物，這會造成殘留的引物在測序反應過程中參與反應而導致亂峰。

6．如何進行PCR產物純化？

PCR產物首先必須用Agarose膠電泳，將特異擴增的條帶切割下，然后純化。使用凝膠回收試劑盒回收，產物用ddH2O溶解。

7． PCR產物直接測序的好處？

（1) PCR產物直接測序可以反映模板的真實情況；

（2) 省去克隆的實驗費用和時間；

（3) PCR產物測序正確的片段進行下一步克隆實驗使結果更有保障；

（4) 混合模板進行PCR的產物直接測序可以發現其中的點突變。

8．對用于測序的質粒DNA的要求有哪些？

對測序模板DNA的一般要求：

（1)DNA純度要求高，1.6—2.0之間，不能有混合模板，也不能含有RNA，染色體DNA，蛋白質等；

（2)溶于ddH2O中，溶液不能含雜質，如鹽類，或EDTA等螯合劑，將干擾測序反應正常進行。

9．如何鑒定質粒DNA濃度和純度？

我們使用水平瓊脂糖凝膠電泳，并在膠中加入0.5ug/ml的EB(電泳緩沖液中不必加EB)，加一個已知濃度的標準樣品。電泳結束以后在紫外燈下比較亮度，判斷濃度和純度。此方法可以更直接、準確地判斷樣品中是否含有染色體DNA、RNA等，也可以鑒別抽提的質粒DNA的不同構型。

質粒DNA的3種構型是指在抽提質粒DNA過程中，由于各種原因的影響，使得超螺旋的共價閉合環狀結構的質粒(SC)的一條鏈斷裂，變成開環狀(OC)分子，如果兩條鏈發生斷裂，就變成為線狀(L)分子。

這3種分子有不同的遷移率，通常，超螺旋型(SC)遷移速度最快，其次為線狀(L)分子，最慢為開環狀(OC)分子。

使用紫外分光光度計檢測，或者用溴乙錠-標準濃度DNA比較法只能檢測抽提到的產物中的濃度，甚至由于抽提的質粒DNA中含有RNA、蛋白質、染色體DNA等因素的干擾，濃度檢測的數值也是沒有多少意義的。

10．為什么抽提的質粒最好溶解在ddH2O中？

全自動熒光測序由于反應體系小，所以對于模板DNA的質量要求比手工測序高許多。通常的提取質粒的試劑盒會提供一個Elution Buffer給用戶洗脫DNA，我們建議用戶不要使用。因為其中含有的如EDTA等組分會對測序反應產生干擾，甚至導致測序反應失敗。

11．對測序引物的要求有哪些？

對測序引物的一般要求：

(1)特異性與測序模板結合，不能有多于4個堿基以上的錯配現象；

(2)不能含有混合堿基；

(3)長度17-25堿堿；

(4)純度高，最好PAGE純化；

(5)用ddH2O溶解，不要用TE溶解。

12．為什么測序引物必須特異地與DNA模板結合？

測序引物與待測樣品DNA分子只能有一個結合位點是測序成功的前提。如果測序引物在DNA模板分子上有不只一個的結合位點，將造成測序反應過程中引物鏈在幾個結合位點處同時擴增，從而得到鏈長相同而組成不相同的終止鏈，測序電泳時收集到重疊峰或亂峰，無法讀取序列

13．為什么測序引物3'端以后有30-50堿基無法讀到？

全自動熒光測序方法由于使用標記了大熒光染料的ddNTP，一些未反應完的ddNTP底物會連同測序反應產物一并被沉淀，在測序電泳時會干擾測序信號，導致這部分堿基無法讀清。

一般的我們會在分析結果時切掉這部分無意義的數據。通常這也是載體的序列。所以選取測序引物時要使引物3'端離開要求測序的起始位置50bp以上比較合適。而對于PCR產物測序就不可避免使得測序引物區域附近無法讀到數據。

14.為什么在測序報告上找不到引物序列？

有如下幾種情況:

（1）找不到測序所用的引物序列。這是正常的，因為熒光測序方法采用的是熒光標記了的ddNTP，自動測序儀通過檢測ddNTP上的熒光來讀取序列。由于引物本身是不被標記的，所以在測序結果中也是找不到的。

（2）找不到克隆片段的擴增引物。原因可能是您在構建質粒時所用的酶的酶切位點距離您的測序引物太近，由于熒光染料的干擾在序列開始的部分判讀不清。

（3）還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的，這時可以找一下引物的互補序列。

（4）存在單引物擴增，有一條引物的特異性不好，有多個結合位點，導致只有一條引物參與擴增。

15．什么是Primer Walking 測序？

大于片斷較大的樣品，雙向測序如果不能完quan拼接，我們還可以為用戶按照上一個測序結果在一定的位置左右設計引物繼續測序，并將測序結果拼接，即Primer Walking 測序。

16．超過6Kb的DNA片斷如何進行測序？

超過6Kb的DNA片斷用Shot Gun 進行測序準確并且節省時間， Shot Gun方法如下：

（1）用物理方法打碎DNA；

（2）回收1～1.5Kb的片斷；

（3）用核酸酶切平端，連接入載體；

（4）按照一定比例進行測序，保證每一個區段有3倍以上的數據；

（5）編輯所有測序數據；

（6）如果有缺少數據的區域，還需要補充測序。拼接成完整序列。

17.為什么測序結果完quan不是所需的序列？

出現這樣的情況只有兩種可能：

（1）我們給您的測序結果對應的不是您的樣品；

（2）您的樣品插入部分與您預期的不一致。

這時需要雙方將樣品進行驗證（PCR和酶切鑒定）。

18.樣品送測序前已經鑒定過了，有插入片段的，為什么測序結果是一個空質粒？

測序是對樣品的最好驗證.結果為空載，可能如下：

（1）可能在培養過程中發生插入片段的丟失，由于這種情況的發生無法事先預期到；

（2）提供的克隆是假陽性克隆。