懸浮細胞轉染步驟及優化注意事項

來源：杭州仟諾生物科技有限公司 2023年04月11日 11:17

　　懸浮細胞是指細胞生長不依賴支持物表面，在培養液中呈懸浮狀態生長，如淋巴細胞。在實驗室經常會遇到懸浮細胞的轉染，其和貼壁細胞轉染有很大的不同。

　　懸浮細胞轉染通常可能遇到：

　　1.效率明顯低于貼壁細胞。

　　2.細胞不易培養，死亡率高。

　　3.轉染試劑毒性大，細胞死亡加劇這三種問題，為了提高懸浮細胞的轉染效率，可以使用毒性較小的非脂質體的轉染試劑，也可以使用電轉染方法，提高細胞轉染效率，電擊對細胞有一定的損傷，最好選用具有細胞膜修復功能的電轉染試劑，可以將電擊對細胞的傷害降到。

　　轉染過程中，操作步驟一定要謹慎。

　　以24孔板siRNA轉染為例

　　1.提前1天細胞種植

　　懸浮細胞：采用對數生長期的細胞，數量為常規培養細胞數的1/3進行轉染實驗。如某細胞常規培養的細胞數是6×10^5，那么就用2×10^5的細胞進行轉染。

　　2.轉染過程

　　⑴取0.67μg(50pmol)的siRNA，加入一定量無血清稀釋液，充分混勻，制成RNA稀釋液，終體積為25μl。

　　注意：無血清稀釋液建議采用OPTI-MEM、無血清DMEM或1640。

　　⑵取1μl的Entranster-R4000，然后加入24μl無血清稀釋液體，充分混勻，制成Entranster-R4000稀釋液，終體積為25μl。室溫靜置5分鐘。

　　⑶將Entranster-R4000稀釋液和RNA稀釋液充分混合（可用振蕩器振蕩或用加樣器吹吸10次以上）混合，室溫靜置15分鐘。轉染復合物制備完成。

　　⑷將50μl轉染復合物滴加到有0.45ml全培養基（可含10%血清和抗生素）的細胞上，前后移動培養皿，混合均勻。

　　注意：對本試劑，采用含血清的全培養基有助于提升轉染效率。

　　⑸轉染后6小時觀察細胞狀態，如狀態良好可不必更換培養基，繼續培養24-96小時得到結果。

　　注意：1.siRNA轉染后，繼續培養24-72小時在mRNA水平得到結果，繼續培養24-96小時在蛋白水平得到結果。mRNA轉染后，根據需要在24小時后得到結果。

　　2.在部分實驗室，由于血清和培養條件等差異，轉染后鏡下培養基中可能出現少量黑點狀沉淀，為轉染試劑和血清中蛋白結合產物，不影響轉染結果和細胞狀態，可通過換液除去。

　　如遇轉染效果不佳，可采取優化方案對實驗進行優化：

　　1.優化轉染條件包括：轉染試劑的用量、DNA密度、細胞密度、試劑和DNA混合孵育時間等等。

　　2.同時細胞污染也是造成細胞死亡，轉染效率低下的一大原因。轉染細胞用的質粒必須保證無菌。分享一個小秘訣：將提完質粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，這樣就除菌了。

　　3.轉染用的質粒首先要保證數量，一般為2μg以上。如果質粒純度不夠或者含有細菌LPS或其他對細胞有毒害作用的物質，需要對質粒進行純化和濃縮。

　　4.一般進行轉染的細胞應該處于對數生長期。如果是貼壁細胞的話，貼壁率應該在70-80%；如果是懸浮細胞的話，應該是6×10^5個/孔（24孔板），一般是轉染前一天換液，轉染前用無血清培養基或PBS洗細胞一次。

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