Western Blot(WB)是檢測(cè)一個(gè)基因表達(dá)是否正確及表達(dá)量多少的方法。WB操作簡(jiǎn)單,既可以定性分析表達(dá)產(chǎn)物,同時(shí)還可以指示目的蛋白量的相對(duì)變化。作為一種有活性的生物大分子,抗體和抗原的反應(yīng)是比較復(fù)雜的,因此用來測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物時(shí)存在著一定的不確定性。所以,在WB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中加入良好的參照體系,對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析是非常有幫助的。 參照體系通常包括分子量Marker(用來確定蛋白條帶對(duì)應(yīng)的分子量大小),空白載體對(duì)照(如果是誘導(dǎo)表達(dá)體系還應(yīng)該有誘導(dǎo)前的對(duì)照),已知量標(biāo)準(zhǔn)產(chǎn)物的正對(duì)照,此外還有內(nèi)參。
內(nèi)參是zui容易被忽略的一項(xiàng),如果要用WB比較不同條件下或者不同組織中,目的蛋白表達(dá)量的相對(duì)多少,等量的細(xì)胞上樣才有比較的基礎(chǔ)。特別表達(dá)量不高時(shí),上樣量的差別就很可能影響結(jié)果的分析,所以此時(shí)內(nèi)參就顯得尤為重要。
內(nèi)參即是內(nèi)部參照(Internal Control),對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白(Housekeeping Proteins),它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物。在WB實(shí)驗(yàn)中,除了需要進(jìn)行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上樣電泳、轉(zhuǎn)膜、靶蛋白抗體孵育、顯色等步驟以外,還需要進(jìn)行內(nèi)參的檢測(cè),以校正蛋白質(zhì)定量、上樣過程中存在的實(shí)驗(yàn)誤差,保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
蛋白濃度測(cè)定是比較各種樣品間上樣量的*方法。然而各種蛋白質(zhì)濃度定量方法都存在局限性,不能*準(zhǔn)確的確定各種樣品的準(zhǔn)確蛋白濃度。如UV法直接定量,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì),相對(duì)于比色法來說,操作簡(jiǎn)單,但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;且敏感度低,要求蛋白的濃度較高。比色法測(cè)定蛋白濃度一般有BCA,Bradford,Lowry 等幾種方法。BCA法與Lowry法都容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。Bradford 法敏感度zui高,且與一系列干擾Lowry,BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT,巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的,其zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大,無可比性。另外,蛋白質(zhì)定量以后進(jìn)行電泳時(shí)需要等量上樣,此步驟也存在操作誤差。在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)使用內(nèi)參,即可簡(jiǎn)便地對(duì)定量和上樣步驟產(chǎn)生的誤差進(jìn)行校正。
在WB中使用內(nèi)參其實(shí)就是在WB過程中的另外用內(nèi)參對(duì)應(yīng)的抗體檢測(cè)內(nèi)參,這樣在檢測(cè)目的產(chǎn)物的同時(shí)可以檢測(cè)內(nèi)參的表達(dá),由于內(nèi)參在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,這樣半定量的結(jié)果才更為可信。此外使用內(nèi)參可以作為空白對(duì)照,檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜情況是否*、整個(gè)WB顯色或者發(fā)光體系是否正常。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析其實(shí)很簡(jiǎn)單:如果樣品蛋白量有限,只夠進(jìn)行一次電泳轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)時(shí),分別檢測(cè)樣品的內(nèi)參量和目的蛋白量。將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量,再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析,得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果。如果樣品量充分,可以先檢測(cè)內(nèi)參,觀測(cè)樣品間內(nèi)參顯色條帶是否一致,根據(jù)差異大小調(diào)整各樣品的上樣量重新進(jìn)行Western Blotting實(shí)驗(yàn),至內(nèi)參量一致為止;若內(nèi)參一致,即可進(jìn)行不同樣品間目的蛋白表達(dá)變化分析。常用的蛋白質(zhì)內(nèi)參有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和細(xì)胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。