在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們通常通過(guò)凍存的手段讓細(xì)胞代謝變得緩慢，從而達(dá)到長(zhǎng)期保存或保種的目的，以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)的使用，那么如何讓細(xì)胞“凍”起來(lái)使之不變與永恒逐漸成為一個(gè)熱門話題，接下來(lái)一起來(lái)探究一下吧！

【低溫儲(chǔ)存】

隨著細(xì)胞被冷凍至冰點(diǎn)以下，懸液中冰晶和溶質(zhì)的濃度有所增加。如果冷卻過(guò)程中，胞內(nèi)水分可以滲出細(xì)胞，則可以減少胞內(nèi)冰晶。通常1℃/min的降溫速度可以促進(jìn)此過(guò)程。但是，水分的喪失會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞收縮，當(dāng)這種收縮達(dá)到一定程度，又會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活性的劇烈下降。冷凍保護(hù)劑，如甘油或者二甲基亞砜（DMSO，貨號(hào)：D2650），可以緩解這種效應(yīng)。細(xì)胞凍存的標(biāo)準(zhǔn)程序是在含有冷凍保護(hù)劑的培養(yǎng)基中，將細(xì)胞緩慢冷凍至–70℃，然后將凍存管轉(zhuǎn)移到液氮中以保持低于–130℃的環(huán)境。

【凍存液】

5%-10%的甘油和DMSO是最常見(jiàn)的凍存保護(hù)劑。雖然DMSO對(duì)細(xì)胞有毒性，但是與甘油相比，其滲入細(xì)胞的速度更快，而且凍存重復(fù)性更好（而且細(xì)胞復(fù)蘇效率更好）。但是，DMSO一方面會(huì)導(dǎo)致某些細(xì)胞（如HL-60早幼粒細(xì)胞）分化，另一方面對(duì)某些細(xì)胞（如HBE4-E6/E7肺上皮細(xì)胞）的毒性也過(guò)大。對(duì)于這些細(xì)胞，則應(yīng)使用甘油。甘油可以通過(guò)高壓蒸汽滅菌，而DMSO只能通過(guò)過(guò)濾除菌。DMSO或者甘油至少應(yīng)達(dá)到試劑級(jí)（或者更高級(jí)別，如細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)），并且分裝，避光保存。

【凍存管】

凍存管材質(zhì)分為兩種：玻璃或者塑料。玻璃管更難操作，但更適合珍貴細(xì)胞的長(zhǎng)期保存，而且一旦適當(dāng)密封，其安全性也更高。

【程序降溫盒】

有很多方法可以實(shí)現(xiàn)1℃/min的降溫速度。電腦控制的可編程電子降溫系統(tǒng)是很好的方式，可以精確保持降溫速度。

比較經(jīng)濟(jì)的方式是將凍存管放置于凍存盒中，在低于–70℃的冰箱中凍存24小時(shí)。已有一些商業(yè)化凍存盒產(chǎn)品能夠非常接近1℃/min的理想降溫速度。或者可以將凍存管放置于壁厚大約15mm的1L容積的聚苯乙烯盒子中，并填充入紙、棉絨或者泡沫起到隔熱的作用。

【液氮罐凍存】

長(zhǎng)期保藏所需要的超低溫（低于 -130℃）環(huán)境，可以使用低溫冰箱，更普遍的方法是保存在液氮罐中。液氮儲(chǔ)存分為兩種方式：將凍存管浸入液氮中或者懸于液氮液面以上的蒸氣中。液體體系需要更多的液氮，后期維護(hù)簡(jiǎn)單，但是液氮有可能進(jìn)入密封不嚴(yán)的凍存管中，并在細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)發(fā)生凍存管爆炸。

因此，強(qiáng)烈建議保存在液氮蒸氣中。液氮蒸氣會(huì)在罐內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)垂直的溫度梯度。液氮底層為-196℃，而上層溫度會(huì)受到液氮余量和液氮罐敞開(kāi)時(shí)長(zhǎng)的影響。為保證儲(chǔ)存安全，請(qǐng)確保罐中液氮充足，以使上層溫度低于-130℃。所有的儲(chǔ)存系統(tǒng)都應(yīng)配備溫度報(bào)警裝置。

【凍存程序】

以下程序適用于大多數(shù)細(xì)胞，如果必要，可以適當(dāng)調(diào)整。凍存培養(yǎng)基的配方請(qǐng)參考其細(xì)胞說(shuō)明書(shū)。

1.凍存前先檢測(cè)細(xì)胞是否受到細(xì)菌、真菌、支原體和病毒的污染。通常凍存后10-14天才能得到污染檢測(cè)結(jié)果，如果確定有污染，應(yīng)將該細(xì)胞銷毀。

2.凍存培養(yǎng)基由wan全培養(yǎng)基和5% DMSO（sigma D2650）組成。由于DMSO的溶解會(huì)放熱，所以不能向細(xì)胞懸液中直接加入未稀釋的DMSO。

3.以溫和速度（125g×10 min）離心收集細(xì)胞，并以1×10*6-5×10*6活細(xì)胞/ml的密度重懸細(xì)胞。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞直到復(fù)蘇后細(xì)胞活性得以確定。

4.在凍存管上標(biāo)記好細(xì)胞名稱，編號(hào)和凍存日期等信息。然后每管加入1-1.8 ml細(xì)胞懸液（視凍存管體積）并密封。

5.室溫條件下，將細(xì)胞在凍存培養(yǎng)基中平衡15-40 min（勿超）。這段時(shí)間中，可以將細(xì)胞懸液等分加入凍存管中。40min后，細(xì)胞活性可能會(huì)受到DMSO的影響而下降。

6.將凍存管置于已預(yù)冷至4℃的程序降溫盒，并將降溫盒置于-70℃（或更冷）的冰箱中至少24小時(shí)。或者，使用已預(yù)冷至4℃的可編程電子降溫系統(tǒng)以1℃/min的速度將凍存管降溫至-40℃以下，然后迅速降至-130℃。

7.將凍存管迅速轉(zhuǎn)移至液氮罐或者-130℃冰箱。通常，冷凍的細(xì)胞會(huì)以10℃/min的速度升溫，一旦達(dá)到-50℃以上，細(xì)胞會(huì)劇烈受損。

8.記錄凍存位置和過(guò)程細(xì)節(jié)等信息。

9.置于-130℃ 24小時(shí)后，取出一只凍存管并復(fù)蘇，以測(cè)定細(xì)胞活性和是否污染。

本期內(nèi)容：如何讓細(xì)胞“凍”起來(lái)？

下期內(nèi)容：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中為什么要“慢凍快融”呢？