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分子實(shí)驗(yàn)之如何保證樣本核酸穩(wěn)定?

來源:愛必信(上海)生物科技有限公司   2023年11月17日 09:29  

科研狗起早摸黑做了幾天分子克隆實(shí)驗(yàn),

本想著拖了好幾個(gè)星期的實(shí)驗(yàn)終于要做完啦!瞬間覺得自己棒棒噠!

但是最后看實(shí)驗(yàn)結(jié)果!!! 原地裂開


 

排查實(shí)驗(yàn)試劑,沒問題!

排查實(shí)驗(yàn)操作,沒問題!

排查儀器,沒問題!

那么問題到底出在哪呢?


 

其實(shí)問題有可能出現(xiàn)在樣本保存與前處理步驟中哦。生物樣本中的核酸(DNA/RNA)會(huì)因?yàn)楹怂崦浮囟取H值、微生物、自身化學(xué)性質(zhì)等因素而發(fā)生被動(dòng)或主動(dòng)降解,從而導(dǎo)致分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果不盡人意。目前針對(duì)不同科研的需求,更多的樣本保存方式也相繼問世,小愛為大家匯總了各類樣本保存的步驟、注意事項(xiàng)、以及樣本保存耗材或保存液的推薦。


一、實(shí)驗(yàn)樣本主要類型:

 

分子實(shí)驗(yàn)中主要的樣本類型有:純核酸類、組織類、細(xì)胞類及環(huán)境類。不同樣本具有不同的保存方式以及操作注意事項(xiàng)。


圖1 常見的實(shí)驗(yàn)樣本類型

 

表1 不同類型樣本核酸保存方法及穩(wěn)定性


類型

檢測(cè)目標(biāo)

穩(wěn)定性及保存注意事項(xiàng)

組織

DNA/RNA

新鮮組織應(yīng)盡快加入到含有核酸保護(hù)劑的管中,放置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室;石蠟包埋組織中的核酸在室溫即可保持穩(wěn)定。

血液

全血的DNA/RNA

DNA:全血室溫可穩(wěn)定保存24h,2-8℃穩(wěn)定保存72h,-20℃可長(zhǎng)期保存

RNA:室溫不建議保存,樣本應(yīng)至于含有核酸穩(wěn)定劑的管中,放置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室。

血清/血漿的cfDNA/ctDNA/病毒DNA/病毒RNA

cfDNA:2-8℃,8h內(nèi)分離血漿,-20℃或更低溫度穩(wěn)定保存;

ctDNA:抽血后4-5h內(nèi)即需要完成核酸提取;

病毒DNA:2-8℃穩(wěn)定一周,-20℃穩(wěn)定一年以上;

病毒RNA:2-8℃,6h內(nèi)分離血漿,-20℃或更低溫度保存

干血片的DNA

室溫穩(wěn)定保存19個(gè)月,需要注意防潮。

細(xì)胞

DNA/RNA

37℃保持細(xì)胞活力即可。

骨髓

RNA

必須在采集后立即至于RNA穩(wěn)定劑中,或者于液氮中速凍

胸水、腦水、腦脊液等其他生物體液樣本

DNA

低溫(2-8℃)保存,盡快提取檢測(cè)。




 

二、實(shí)驗(yàn)樣本前處理步驟及注意事項(xiàng)

 

1、組織樣本:


塊狀組織樣本短時(shí)間內(nèi)無法充分裂解,一般需要進(jìn)行樣本預(yù)處理。組織取材在組織離體30min內(nèi)完成,取樣的動(dòng)作要盡量快速利索,將組織按任一方向切成黃豆粒大小。


組織DNA提取:新鮮組織樣本用生理鹽水清洗2次,即刻進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。如若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn),可用液氮速凍,-80℃凍存。


組織RNA提取:將動(dòng)物或植物組織切成小塊,在液氮中磨碎或用勻漿器勻漿處理,快速轉(zhuǎn)入裝有1mL Trizol(abs60154)的2mL離心管中,立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。若后期再進(jìn)行實(shí)驗(yàn),盡量保存時(shí)將樣本浸入RNA樣品保存液(abs9268)后置4℃冰箱過夜(4℃過夜是必需的,這樣可使RNA樣品保存液滲入到組織中),然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱。或者液氮研磨組織,加入Trizol,放入-80℃保存。


圖2 組織樣本RNA提取流程圖

 

2、細(xì)胞樣本:


DNA提取:細(xì)胞收集沉淀后,進(jìn)行液氮速凍,-80℃保存。


RNA提取:

1)貼壁細(xì)胞:吸盡培養(yǎng)液,每10cm2培養(yǎng)面積加入1mL Trizol,用加樣器吹打數(shù)次,以確保細(xì)胞裂解,然后轉(zhuǎn)移至離心管中。注:貼壁細(xì)胞Trizol的使用量應(yīng)由培養(yǎng)皿表面積決定,而非由細(xì)胞數(shù)目決定。Trizol量不足可能導(dǎo)致提取的RNA中有DNA污染;
2)懸浮細(xì)胞:離心收集細(xì)胞,吸盡液體,每5-10×106動(dòng)植物或酵母細(xì)胞,或每1×107細(xì)菌細(xì)胞加入1mL Trizol,用加樣器吹打,使其裂解,然后轉(zhuǎn)移至離心管中。 注:添加Trizol前切勿洗滌細(xì)胞,以免RNA降解。必要時(shí)可以用勻漿器來裂解某些細(xì)菌或者酵母細(xì)胞。若后期再進(jìn)行RNA提取實(shí)驗(yàn),細(xì)胞用液氮速凍,-80℃凍存。

 

3、血液樣本:


采用含有抗凝劑的真空采血管保存即可。但采血管中的抗凝劑種類多樣,抗凝劑的種類也會(huì)直接影響后續(xù)檢測(cè)結(jié)果,面對(duì)這么多的采血管如何進(jìn)行選擇?我們建議使用EDTA或枸櫞酸鈉抗凝管,不建議使用肝素抗凝管(因肝素在后面的核酸提取過程中很難去除,且肝素對(duì)PCR反應(yīng)有很強(qiáng)的抑制作用,因此不建議使用肝素抗凝管)。采集完血液,顛倒混勻備用。另外冰凍血液溶解過程中會(huì)有破碎的細(xì)胞釋放RNA酶,因此在冰凍前加入Trizol,切勿直接凍存新鮮血液,保存好的血液應(yīng)避免反復(fù)凍融。

 

4、血清/血漿樣本:


全血不加抗凝劑分離的上清是血清,加入抗凝劑分離的上清是血漿。取全血后,靜止1-2h,置于離心機(jī)3000rpm離心15min即可獲得血清或血漿。


三、樣本前處理利器—RNA樣品保存液(abs9268)

 

RNA樣品保存液是一種無毒的可直接使用的樣品儲(chǔ)存液,能使細(xì)胞內(nèi)的RNARNA酶分離,防止樣本中RNA表達(dá)譜發(fā)生變化。加入樣本保存液的樣本中RNA在室溫可以保存7天4℃可以保存4周-20℃-80℃標(biāo)本可以長(zhǎng)期保存。在RNA樣品保存液中保存的標(biāo)本,反復(fù)凍融至室溫20次不影響RNA的質(zhì)量。

 

操作步驟:

1)計(jì)算保存液用量:根據(jù)要保存的各樣本的體積,計(jì)算出所需RNA樣品保存液用量;a:RNA樣品保存液的用量應(yīng)當(dāng)是組織體積的10倍(100mg組織約用1mL RNA樣品保存液);b:離心收集2×107細(xì)胞RNA樣品保存液的用量是1mL;
2)分裝:RNA樣品保存液按需要量分裝入自備保存管中;
3)切片:快速將較大的組織切成厚度<0.5cm的任意片狀,較小的組織直接取下,立即浸入RNA樣品保存液中;
4)保存:保存時(shí)先將樣本浸入RNA樣品保存液后置4℃冰箱過夜,然后轉(zhuǎn)移到-20℃冰箱或繼續(xù)轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱。


四、本期小愛產(chǎn)品推薦


貨號(hào)

產(chǎn)品名稱

規(guī)格

abs9268

RNA樣品保存液

100mL

abs9474

組織保存液

100mL

abs60150

RNA酶抑制劑

2000U

abs60154

Trizol

100mL

abs9259

無酶無菌水(DEPC水)

500mL





 



Absin特色產(chǎn)品線:

WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動(dòng)劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測(cè))...

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