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四环素类检测试剂盒使用说明书

（酶联免疫法）

1 原理及用途

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测组织、蜂蜜、鸡蛋等样本中的四环素类药物（Tetracyclines，TCs），试剂盒由预包被偶联抗原的酶标板、辣根酶标记物、抗体、标准品及其他配套试剂组成。检测时，加入标准品或样品溶液，样本中的四环素类药物和酶标板上预包被偶联抗原竞争抗四环素类药物抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光度值与其所含四环素类药物含量成负相关，与标准曲线比较即可得出样本中四环素类药物的残留量。

2 技术指标

2.1 试剂盒灵敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反应模式：37℃，30min～30min～15min

2.3 检测下限：

组织、肝脏、鸡蛋…………………2ppb

蜂蜜…………………………………2ppb

尿样………………………………0.5ppb

牛奶…………………………………2ppb

奶粉…………………………………4ppb

2.4 交叉反应率：

四环素………………………………100%

土霉素………………………………107%

金霉素………………………………16.7%

强力霉素……………………………4.2%

 2.5 样本回收率：

组织、肝脏、鸡蛋…………75±20%

蜂蜜…………………………80±20%

尿样…………………………80±20%

牛奶、奶粉…………………75±20%

3 试剂盒组成

酶标板………………………96孔

高浓度标准品溶液1瓶：（1ml/瓶）1.0ppm（高标准液有挥发性，需注意密封）

标准品溶液0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb（均为空瓶子，现配现用）。

酶标记物（红盖）……………………11ml

抗体工作液（蓝盖）…………………5.5ml

底物液A（白盖）……………………6ml

底物液B（黑盖）……………………6ml

终止液（黄盖）………………………6ml

20×浓缩洗涤液（白盖）……………40ml

5×复溶液（黄盖） …………………50ml

说明书…………………………………1份

盖板膜…………………………………1张

自封袋…………………………………1个

4 需要的器材和试剂  四环素类检测试剂盒使用说明书

4.1 仪器：酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：单道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 试剂：浓盐酸、无水甲醇

5 样本前处理

5.1 样本处理前须知：

实验器具必须洁净并使用一次性吸头，以避免污染干扰实验结果。

5.2 配液：

配液1：复溶液

将5×复溶液用去离子水5倍稀释（1份5×复溶液加4份去离子水），用于样本的复溶，复溶液在4℃环境可保存一个月。

配液2：工作洗涤液

    将浓缩洗涤液20倍稀释(1份洗涤液加19份去离子水)。配液3：样本提取液

取4.3mL浓盐酸加去离子水混匀，定容至50mL，再加入450ml无水甲醇。

5.3 样本前处理步骤：

5.3.1 组织、肝脏、鸡蛋样本处理方法

1）准确称取1±0.05g均质后的样本于离心管中，加入2ml 样本提取液（配液3），剧烈振荡2min，使样本分散，充分与有机相接触，室温4000转/分以上，离心5min；

2）取出50ul上层液体（样本脂肪多最上层会有白色漂浮物，不要取到）,加入950ul复溶液混匀；

3）取50 µl用于分析。

    样本稀释倍数：40    检测下限：2ppb

5.3.2 蜂蜜样本处理方法

1）准确称取1±0.05g蜂蜜样本于离心管中，加入1ml样本提取液（配液3），振荡混匀2min，使蜂蜜充分溶解；

2）取出50ul混合液,加入950ul复溶液混匀；

3）取50µl用于分析。

    样本稀释倍数：40    检测下限：2ppb

5.3.3 尿样本的处理方法

1）用复溶液将尿样10倍稀释（如果尿样浑浊一定要过滤或离心10min，4000r/min，直至得到清亮尿样），暂不使用的样本应冷冻保存。

2）取50µl稀释的尿样用于分析。

    样本稀释倍数：10    检测下限：0.5ppb

5.3.4 牛奶样本处理方法

1）准确吸取1ml牛奶于离心管中， 加2ml样本提取液（配液3），振荡2min，室温4000转/分以上，离心5min；

2）取50ul上层液，加入950ul复溶液，混匀；

3）取50µl用于分析。

样本稀释倍数：40    检测下限：2ppb

5.3.5 奶粉样本处理方法

1）准确称取1±0.05g奶粉于离心管中，加入4ml样本提取液（配液3），振荡2min，室温4000转/分以上，离心5min；

2）取50ul上层液，加入950ul复溶液，混匀；

3）取50µl用于分析。

    样本稀释倍数：80    检测下限：4ppb

6 酶联免疫试验步骤

    将所需试剂从4℃冷藏环境中取出，置于室温平衡30min以上, 洗涤液冷藏时可能会有结晶需恢复到室温以充分溶解，每种液体试剂使用前均须摇匀。取出需要数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

实验开始前需配制标准品应用液；低浓度的标准品不稳定，需现配现用。

在0ppb的瓶中加复溶液3ml，0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb的瓶中分别加复溶液2ml，4.05ppb的瓶中加复溶液3ml。

标准液6：取1.0ppm高浓度标准品溶液12ul加入装有3ml 复溶液4.05ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为4.05ppb。

标准液5：取1ml标准液6加入装有2ml 复溶液1.35ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为1.35ppb。

标准液4：取1ml标准液5加入装有2ml 复溶液0.45ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.45ppb。

标准液3：取1ml标准液4加入装有2ml 复溶液0.15ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.15ppb。

标准液2：取1ml标准液3加入装有2ml 复溶液0.05ppb的瓶中，盖紧，混匀，浓度即为0.05ppb。

标准液1：直接使用复溶液，浓度即为0ppb。四环素类检测试剂盒使用说明书

6.1 编    号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

6.2 加样反应：加标准品应用液或样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体工作液50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光反应30分钟。

6.3 洗    涤：小心揭开盖板膜，甩去孔内液体，每孔加350ul工作洗涤液，静置30秒后弃去，重复洗涤5次，最后一次拍干。（用吸水纸拍干，拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

6.4 加酶反应：加酶标记物100µl/孔，37℃避光反应30分钟。

6.5 洗    涤：同上

6.6 显    色：加底物液A 50µl/孔，再加底物液B 50µl/孔，轻轻振荡5秒混匀，37℃避光显色15分钟（若蓝色过浅，可适当延长反应时间）。

6.7 终    止：加终止液50µl/孔，轻轻振荡混匀，终止反应。

6.8 测吸光值：用酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值（建议用双波长450/630nm）。测定应在终止反应后10分钟内完成。

7 结果分析

7.1 百分吸光率的计算

    标准液或样本的百分吸光率等于标准液或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb标准溶液的平均吸光度值

7.2 标准曲线的绘制与计算

    以标准液百分吸光率为纵坐标，对应的标准液浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准液的半对数曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中待测物的实际浓度。

    若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

8 注意事项

8.1 室温低于25℃或试剂及样本没有回到室温（25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

8.2 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

8.3 混合要均匀，洗板要，在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育过程中，用盖板膜封住微孔板，避免光线照射。

8.5 不要使用过了有效期的试剂盒，不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

8.6 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8.7 反应终止液有腐蚀性，避免接触皮肤。

9 贮藏及保存期

储藏条件：试剂盒于2-8℃保存，避免冷冻。

保 质 期：该产品有效期为1年，生产日期见包装盒。

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