生物制品是指以微生物、寄生蟲、動(dòng)物毒素、生物組織作為起始材料,采用生物學(xué)工藝或分離純化技術(shù)制備,并以生物學(xué)技術(shù)和分析技術(shù)控制中間產(chǎn)物和成品質(zhì)量制成的生物活性制劑,包括菌苗、疫苗、毒素、類毒素、免疫血清、血液制品、免疫球蛋白、抗原、細(xì)胞因子、激素、酶、發(fā)酵產(chǎn)品、單克隆抗體、DNA重組產(chǎn)品、體外免疫診斷制品等。由于其特殊的性質(zhì),生物制品的質(zhì)量控制至關(guān)重要,國家規(guī)定應(yīng)當(dāng)對(duì)生物制品的生產(chǎn)過程和中間產(chǎn)品的檢驗(yàn)進(jìn)行特殊控制,為響應(yīng)這一要求,一系列生物制品生產(chǎn)研發(fā)過程中相關(guān)雜質(zhì)的檢測試劑盒誕生,大致可分為兩大類,一類是檢測細(xì)胞來源的污染物,例如來自包裝細(xì)胞系或細(xì)菌的宿主細(xì)胞蛋白和DNA,另一類則是檢測生產(chǎn)中使用的輔助病毒、質(zhì)粒DNA、牛血清、核酸酶、蛋白酶、抗生素等物質(zhì)。
細(xì)胞來源污染物檢測
1、宿主細(xì)胞DNA/DNA片段殘留檢測
生物制品中的重組蛋白藥、抗體藥、疫苗等產(chǎn)品是用連續(xù)傳代的動(dòng)物細(xì)胞株表達(dá)生產(chǎn),雖然經(jīng)過嚴(yán)格的純化工藝,但產(chǎn)品中仍有可能殘余宿主細(xì)胞DNA,不同宿主細(xì)胞殘留的DNA帶來的潛在威脅并不相同,盡管它們有著相同的基本結(jié)構(gòu)單位,但其片段長度不同,以不同的物理形式存在,進(jìn)入人體后可造成多種多樣的后果,如致癌性、感染性等。因此從安全角度,在生物制品的生產(chǎn)工藝對(duì)殘留DNA進(jìn)行檢驗(yàn)驗(yàn)證是有必要的。
《中國藥典》、《美國藥典》和《歐洲藥典》均提及用qPCR法對(duì)DNA殘留量進(jìn)行測定。TaqMan®熒光探針是一種寡核苷酸探針,其5’末端攜帶熒光基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán)),如 FAM、TET、VIC等,3’端攜帶淬滅基團(tuán),如 TAMRA、BHQ1等。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一條特異性的熒光探針,探針完整時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)(熒光定量PCR儀)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等特點(diǎn),在目前生物制藥細(xì)胞核酸殘留檢測中被廣泛使用。
表 《中國藥典》2020版部分疫苗生物制品殘留DNA標(biāo)準(zhǔn)
來源 | 細(xì)胞 | DNA殘留標(biāo)準(zhǔn) |
凍干乙型腦炎滅活疫苗 | Vero細(xì)胞 | 100pg/劑 |
雙價(jià)腎綜合征出血熱滅活疫苗 | Vero細(xì)胞 | 100pg/劑 |
凍干人用狂犬疫苗 | Vero細(xì)胞 | 3ng/劑 |
Sabin株脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗 | Vero細(xì)胞 | 50pg/劑 |
重組乙型肝炎疫苗 | CHO細(xì)胞 | 10pg/劑 |
2、宿主蛋白(HCP)殘留檢測
宿主蛋白即由宿主細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白,包括目的蛋白和宿主細(xì)胞本身的蛋白,它的存在可能誘發(fā)不良免疫反應(yīng),也可能導(dǎo)致藥效發(fā)生變化,因此需要對(duì)原料藥和下游純化過程(DSP)中間體中的HCP進(jìn)行表征和量化。多國藥典規(guī)定酶聯(lián)免疫法(ELISA)作為HCP定量方式,《中國藥典》2020版明確規(guī)定CHO細(xì)胞殘余蛋白占總蛋白含量要保持在0.05%以下。
圖 Absin CHO HCP ELISA Kit(abs590005)快速操作流程
工藝雜質(zhì)殘留檢測
1、培養(yǎng)添加劑殘留檢測
細(xì)胞培養(yǎng)是生物制品生產(chǎn)過程中經(jīng)常用到的手段,牛血清更是被廣泛使用,為細(xì)胞生長提供必須的營養(yǎng)成分,BSA則是在牛血清中大量存在,然而BSA作為外源性蛋白如果跟隨藥物產(chǎn)品進(jìn)入人體,將引發(fā)嚴(yán)重的免疫反應(yīng)并有可能影響藥物效果,因此《中國藥典》2020版對(duì)各種疫苗BSA的殘留量都進(jìn)行了明確的規(guī)定,基本是不高于50ng/mL或者不高于50ng/劑,并且藥典也推薦了酶聯(lián)免疫吸附法用于BSA的含量測定。
除了牛血清外,各類抗生素亦是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的添加劑,如卡那霉素、慶大霉素等,ICH(人用藥品注冊(cè)技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì))將生物制品中的殘留抗生素列為工藝相關(guān)雜質(zhì),要求“通過研究證明其在工藝中可有效控制或去除,并達(dá)到可接受的水平”,《中國藥典》2020版明確規(guī)定對(duì)疫苗等預(yù)防類產(chǎn)品采用酶聯(lián)免疫法測定抗生素殘留,應(yīng)<50ng/劑。
2、Protein A殘留檢測
Protein A有著與某些免疫球蛋白(特別是IgG)的Fc部分的高親和力,因此Protein A親和層析柱被廣泛應(yīng)用于抗體類藥物的分離純化,但是在使用過程中,由于待純化物中存在蛋白水解酶,會(huì)水解Protein A,導(dǎo)致部分Protein A脫落并與抗體結(jié)合殘留在洗脫液中,Protein A具有免疫原性,若進(jìn)入體內(nèi)可能引起不良免疫反應(yīng),因此對(duì)于殘留量需要做質(zhì)控。
3、膠原酶I型殘留檢測
膠原酶廣泛用于將組織消化成單細(xì)胞,消化得到的單細(xì)胞被用于進(jìn)一步生產(chǎn)生物制品,生物制品生產(chǎn)相關(guān)法規(guī)中明確了細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)材料檢測的必要性,故膠原酶的殘留量檢測也愈發(fā)引起重視。
4、內(nèi)毒素檢測
內(nèi)毒素是一種脂多糖,來自革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞壁,會(huì)在細(xì)菌死亡或自溶后被釋放,當(dāng)內(nèi)毒素進(jìn)入生物體,可能引起發(fā)熱反應(yīng),因此也是影響生物制品安全性的重要因素之一,《中國藥典》2020版規(guī)定用鱟試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測。
鱟試劑是一種從動(dòng)物鱟的血液中提取的生物試劑,能夠和內(nèi)毒素發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生凝集沉淀,再應(yīng)用凝膠法或光度測定法檢測生物制品中內(nèi)毒素的含量,為了符合可持續(xù)發(fā)展的原則,科學(xué)家們研發(fā)出了重組鱟試劑,以替代傳統(tǒng)鱟血提取物,從操作流程與分析方法上做到了無感替代。
圖 鱟與鱟試劑檢測原理
參考資料
[1] 國家藥典委員會(huì).中國藥典[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2020:1088.
Absin提供生物制品質(zhì)量控制檢測試劑盒
貨號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
abs551021 | Human IgG ELISA Kit | 96T |
abs590005 | CHO細(xì)胞 HCP(宿主蛋白)殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs590008 | BSA殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs590009 | Protein A殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs590010 | 卡那霉素殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs590011 | 慶大霉素殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs590012 | 膠原酶I型殘留檢測試劑盒 | 96T |
abs60543 | 質(zhì)粒DNA殘留(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60544 | 宿主細(xì)胞殘留DNA(磁珠法)樣本前處理試劑盒 | 100T |
abs60545 | HEK293殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60557 | HEK293殘留DNA片段(qPCR)檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60546 | 293T細(xì)胞殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60558 | 293T細(xì)胞殘留DNA片段(qPCR)檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60547 | Human殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60559 | Human殘留DNA片段(qPCR)檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60548 | Hela細(xì)胞殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60560 | Hela細(xì)胞殘留DNA片段(qPCR)檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60549 | E1A殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60550 | E1A&SV40LTA殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60551 | E.coli殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60552 | E.coli總RNA殘留(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60553 | CHO殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60554 | Vero殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60561 | Vero殘留DNA片段(qPCR)檢測試劑盒 | 100T×4 |
abs60555 | 畢赤酵母殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
abs60556 | PG13殘留DNA(qPCR)檢測試劑盒 | 100T |
好消息!Absin文獻(xiàn)獎(jiǎng)勵(lì)重磅升級(jí)!
Absin特色產(chǎn)品線:
WB相關(guān):ECL發(fā)光液、預(yù)染marker、預(yù)制膠;IHC相關(guān):二抗試劑盒、組化筆;IP/CoIP試劑盒;激動(dòng)劑/抑制劑;血清、BSA、蛋白酶K、CTB、TTX、CEE;凋亡試劑盒;呼吸爆發(fā)試劑盒;ELISA試劑盒;重組蛋白;抗體: 二抗、標(biāo)簽抗體、對(duì)照抗體;定制服務(wù)(抗體/多肽/蛋白/標(biāo)記/檢測)...
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