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含有伯氨基的生物分子的 NHS 酯標記介紹

來源:上海牧榮生物科技有限公司   2024年03月13日 11:37  

NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)酯和其他活化酯(磺基-NHS、磺基四氟苯基 - STP)是適合氨基修飾的反應性化合物。 NHS 是最常見的活化酯類型。

常見的修飾是熒光標記、熒光猝滅劑和其他報告基團。可以使用活化酯連接炔烴和疊氮基,以使生物分子適應點擊化學。

尤其常見的是蛋白質和肽的修飾,因為它們幾乎總是含有氨基。其他例子是氨基寡核苷酸的修飾、氨基修飾的DNA和含氨基的糖。

NHS 酯與氨基的反應強烈依賴于 pH 值:在低 pH 值下,氨基被質子化,并且不會發生修飾。在高于最佳 pH 值時,NHS 酯的水解速度很快,并且修飾分子的產率會降低。改性的最佳pH值為8.3-8.5。

水是用于溶解 NHS 酯以進行生物分子標記的常用溶劑。如果NHS酯難溶于水溶液,可首先將其溶解在 二甲基亞砜(DMSO)或二甲基甲酰胺(DMF)中,然后添加到pH 8.3-8.5緩沖液中的蛋白質溶液中。請注意,DMF 可以降解為二甲胺,二甲胺具有魚腥味,并且能夠與活化酯發生反應。因此,標記生物分子時,使用不含二甲胺、無魚腥味的高質量DMF非常重要。

我們建議使用以下通用方案用Lumprobe 生產的NHS 酯標記生物分子:

  1. 使用下面的公式或我們的蛋白質標記計算器計算所需的 NHS 酯量

    NHS_酯_重量 [mg] = 8 × 氨基_化合物_重量 [mg] × NHS_酯_摩爾_重量 [Da] / 氨基_化合物_摩爾_重量 [Da]。

    8是摩爾過量的NHS酯。它是單標記的經驗值,適用于許多常見的蛋白質和肽。然而,在某些情況下,使用更少或更多的 NHS 酯可以增加修飾生物分子的產量。它取決于蛋白質結構、標記所用試劑及其溶解度。 Lumiprobe 產品的摩爾重量可以在相應的產品頁面上找到。

    例如,要使用 Cy5 NHS 酯(摩爾量 616 道爾頓)標記 3 mg BSA(摩爾量 66500 道爾頓),并獲得單標記產物的最大產量,應使用 8 × 3 mg × 616 Da / 66500 Da = 0.22 毫克 Cy5 染料 NHS 酯。

  2. 計算反應混合物的體積。標記反應中的最佳生物分子濃度為1-10 mg/mL。標記可以在任何規模上進行,從納摩爾到幾十克。如果標記少量生物分子,請將反應混合物的體積保持在低水平 (10-20 uL)。

  3. 將 NHS 酯溶解在 1/10 反應體積的水、DMF 或 DMSO 中。不含二甲胺的DMF或水是優選的溶劑。溶解在 DMF 中的 NHS 酯可在 -20°C 下在溶液中保存 1-2 個月。 NHS酯的水溶液配制后應立即使用。

  4. 將生物分子溶解在 9/10 反應體積的 pH 8.3-8.5 緩沖液中。

    0.1 M 碳酸氫鈉溶液具有適當的 pH 值。另一種選擇是 0.1 M 磷酸鹽緩沖液。請注意,pH 值是成功用 NHS 酯標記生物分子的最重要因素。避免使用含有胺的緩沖液(有時可以使用基于 Tris 的緩沖液,但不推薦使用。Tris 含有氨基,但對活化酯的親和力較低)。

    在進行大規模標記(使用數百毫克 NHS 酯)時,請注意,由于 NHS 酯的水解,混合物會隨著時間的推移而酸化。監測 pH 值,或使用濃度更高的緩沖液。

  5. 將 NHS 酯溶液添加到生物分子溶液中,并充分渦旋。在冰上放置過夜,或在室溫下放置 1 至 4 小時。

  6. 使用適當的方法純化綴合物:大分子凝膠過濾是最常見的。色譜法是另一種選擇。對于蛋白質和核酸,可以使用乙醇或丙酮沉淀。有機雜質(如 N-羥基琥珀酰亞胺、NHS 酯和水解產生的酸)幾乎總是可以通過這些方法輕松分離。


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