化合物庫不僅僅可以應用于藥物篩選，更多情況下我們可以將其靈活應用于信號通路的分子機制研究，進而發現關鍵靶基因 。 一定有新的小伙伴開始暈乎乎了 ，趁著今天復盤，小 M 帶你溫故而知新？

 2023 年客戶引用 MCE 化合物庫發表了 100+ 篇文獻，其中分的文獻是發表在 Cancer Discovery 雜志上的 “An African-Specific Variant of TP53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression”，影響因子已趨近 30。接下來咱們就通過揭示 p53 腫瘤抑制新機制的這篇文獻，來看看化合物庫應該如何用?

腫瘤抑制因子 p53 由 TP53 編碼并參與到人類一半以上癌癥的調控，突變型 p53 會抑制 WT p53 的功能并促進細胞增殖、上皮細胞向間質轉化、血管生成、轉移和耐藥的發生。

在這項研究中，研究團隊試圖通過探索特殊的 TP53 突變如何不能抑制腫瘤，進而轉變確定 p53 是如何抑制腫瘤的。已有的研究結果表明 Y107H 是一種結構上與  WT p53 相似，并在一小部分 p53 靶基因的反激活中存在缺陷的非洲特異的種系變體，為此本文作者展開了基于 Y107H 的研究。更重要的是，作者發現 Y107H  保留了大部分 p53 功能，但小鼠卻患上了癌癥……

首先作者展開了對 Y107H 的功能研究，發現  Y107H 變體在生長抑制和細胞凋亡方面與 WT p53 相當。例如，Y107H 的集落抑制受到適度損害。Doxorubicin 和 γ 輻射處理導致 Y107H LCL 細胞凋亡有所增加。接下來，用 Nutlin-3a  (nutlin) 或 Cisplatin 處理 Y107H 雜合子和 WT p53 的人類 LCL 細胞進行 RNA 測序 (RNA-seq)。該分析揭示了 WT 和 Y107H LCL 中幾乎相同的 p53 靶點激活。然而，在獨立樣本進行 qRT-PCR 分析時，發現 p53 的靶標 PLTP、PADI4 和 HHAT 受到 nutlin 誘導的反式激活明顯受損。Western blot 實驗表明在蛋白質水平上 Y107H LCLs 在 nutlin 處理后，PADI4 上調受阻。γ 輻射后，Y107H 小鼠脾臟和胸腺中的 PADI4 免疫染色也明顯減少 (圖 1)。

圖 1. Y107H 變體對 p53 靶基因子集的反式激活受損^[1]。 

(A) 使用 10 μmol/L nutlin 0、8 和 24 小時后，對 WT 和 Y107H LCL 中CDKN1A (p21)、PADI4、PLTP和HHAT表達水平的平均表達 ± SD 進行定量 PCR 分析（ n = 3 個生物學重復） 。表達標準化為 GAPDH。(B) 10 μmol/L nutlin 處理 0、8 和 24 小時后，WT 和 Y107H 細胞中 PADI4 和 p53 靶蛋白的蛋白質印跡。包括 Nutlin 處理 24 小時 PADI4 蛋白水平的密度測定值，并標準化為 GAPDH。分析代表多個獨立重復。(C) 來自 WT、Y107H 和 PADI4 KO 小鼠 IHC 的陽性細胞百分比定量。(D) 來自接受 5 Gy 照射的 Hupki WT、Y107H 和 PADI4 敲除 (KO) 小鼠的 IHC，4 小時后進行分析（每個條件 n = 3 只小鼠），并對脾臟中的 PADI4 表達進行染色，比例尺，50 μm。

ChIP-qPCR 分析表明，與 WT p53 相比，Y107H 在其反應元件處與染色質的結合能力略有下降，與 HHAT、PLTP 和 PADI4 等靶標的啟動子的結合存在障礙。

結構決定功能，Y107H 與 WT p53 功能的不同也暗示著結構上的差異。研究人員觀察到 Y107H 核心結構域的晶體結構與 WT p53 的結構非常相似，但 Y107H 的核心結構域在熱穩定性降低，也顯示出明顯增強的聚集。免疫熒光分析證實，Y107H 有更強的錯誤折疊成突變體構象的傾向性。

圖 2. Y107H 變體表現出熱穩定性降低和錯誤折疊傾向增加^[1]。

(A) Y107H 的晶體結構。p53 Y107H （黃色） 與 p53 R273H/S240R（青色）的疊加。Y107H 突變以洋紅色顯示。Zn²⁺ 被繪制為灰色球體。(B) p53 Y107H 結構中 H107（洋紅色）的插圖。(C) 通過 DSF 測量，Y107H 突變在熱力學上使核心結構域不穩定。(D) 40°C 下觀察 WT 和 Y107H 核心結構域的聚集動力學。

為了探究 Y107H 在體內的腫瘤抑制能力，研究人員在 C57Bl/6 背景下檢測了攜帶 WT p53 或 Y107H 變體純合子的小鼠自發腫瘤形成。相比于 WT 小鼠，超過 30% 的 Y107H 小鼠在相同時間內發生了腫瘤。此外，作者對 WT 和 Y107H 小鼠進行了分次輻射，發現相比于 WT 小鼠，Y107H 小鼠的 T 細胞淋巴瘤增加并不明顯，但 Y107H 小鼠的彌散性淋巴瘤顯著增加，且小鼠的脾臟和肝臟體積明顯增大 (圖 3 A-C)。

此外，用腺病毒 E1A 和突變 Ras 轉化 WT 和 Y107H MEF，將 E1A/Ras MEF 皮下注射到免疫受損小鼠中，并測量腫瘤隨時間的生長情況。Y107H E1A/Ras 腫瘤的生長速度明顯快于 WT 腫瘤 (圖 3D-E)。

圖 3. Y107H 小鼠自發性和誘導性癌癥的發生率增加^[1]。 

(A) Y107H 小鼠與 WT 分級放療后收獲時肝臟、脾臟和胸腺大小的代表性圖像。(B-C) 來自健康年齡匹配小鼠或接受分割放療的小鼠的脾臟（B）和肝臟（C）組織的平均重量。(D-E)將 E1A/Ras MEF 皮下注射到免疫受損小鼠中的腫瘤重量腫瘤體積 (L) 和代表性腫瘤大小 (E)，顯示為平均重量。

再接下來的研究中，作者通過使用化合物庫開展高通量篩選，來鑒定與 Y107H 存在關聯的小分子化合物，從而進一步去闡明以及完善 Y107H 的功能。

前期已有的研究表明，化療化合物對 P47S (一種 TP53 變體) 的腫瘤細胞的敏感性更高，所以作者想要探究 Y107H 是否也如此。因此，本文作者選擇約 2,000 個抗癌化合物對 Y107H 克隆細胞系進行篩選 (圖 5A)。 
作者鑒定到的了大約 24 種化合物，在兩個 Y107H 克隆中與親本相比，IC₅₀ 降低了 3 倍 (圖 4B)，其中 CB-839 (HY-12248) 和 BPTES 兩種化合物是谷氨酰胺酶抑制劑。隨后作者選擇了 CB-839 進行了進一步的體內抗腫瘤活性篩查。NSG 小鼠皮下注射 WT 或 Y107H HCT116 細胞并測量腫瘤生長情況，當腫瘤大小達到約 50 mm3時，每天兩次灌胃 200 mg/kg 對照組或 CB-839 治療組，結果顯示 Y107H 腫瘤比 WT 腫瘤長得更大，親代 HCT116 腫瘤在 CB-839 處理后沒有顯示出抗腫瘤作用，而 Y107H 腫瘤在 CB-839 處理組中生長顯著減少 (圖 5C-E)。

圖 5. Y107H 結直腸癌細胞對谷氨酰胺酶抑制劑 CB-839 的敏感性增加^[1]。 

(A) 帶有 Y107H 突變的 HCT116 結直腸癌細胞（克隆 A11 和 C2）的 CRISPR 生成以及隨后篩選誘導 Y107H 克隆活力喪失增強的化合物的示意圖。(B) 使用 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 和 C2 檢測化合物針對 HCT116 細胞的 IC₅₀ 值。指出了在兩個 Y107H 克隆中顯示出顯著增加的敏感性的化合物。(C) 在媒介物或 CB-839 處理后，NSG 小鼠中帶有 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 的 HCT116 細胞的腫瘤生長。腫瘤達到 50 mm 3后，通過口服管飼法每天 2 次施用媒介物或 CB-839。線性混合模型估計了 CB-839 治療降低腫瘤生長率（mm³/天）的差異。(D) 最終腫瘤體積，顯示為用載體或 CB-839 處理的 HCT116 腫瘤的平均體積。(E) 用載體或 CB-839 治療的 HCT116 腫瘤的代表性圖像。

前期已有研究表明 ATF4 通路會被被營養剝奪和 CB-839 處理激活，因此在接下來的研究中作者著重討論了 ATF4 與 Y107H 的潛在聯系。數據結果將 p53 對腫瘤的抑制與 PADI4 潛在的免疫表型聯系起來，PADI4 與 p53 相互作用，具有腫瘤抑制作用，并在 p53 靶基因子集的轉錄中與 p53 合作。此外，PADI4 表達增加與黑色素瘤患者的免疫反應增加以及生存率和免疫治療反應增加相關。

本篇文章在確定了對 Y107H 研究的前提下，首先對 Y107H 體內以及體外的功能進行了解析，結構的改變往往是導致功能發生轉變的主要原因，因此作者接下來對 Y107H 的結構進行了分析。隨后，作者通過高通量篩選將 Y107H 與小分子化合物的作用靶點相連接，在篩選到先導化合物之后，作者對 CB-839 的體內外活性展開了研究，并基于 CB-839 前期的研究報道，將 Y107H 與 PADI4 聯系起來，并在不同研究水平以及研究體系對機制進行闡述。

經過統計， 小 M 發現，FDA 上市庫 (HY-L022)、天然產物庫 (HY-L021)、生物活性化合物庫 (HY-L001) 以及激酶抑制劑庫 (HY-L009) 是客戶購買最多的化合物庫。除定制化合物庫以外，客戶選擇購買的化合物庫共有 33 種，其中包含了老藥新用化合物庫系列、信號通路化合物庫系列、天然產物化合物庫系列以及類藥多樣性化合物庫系列等等。

靈活將高通量篩選應用到疾病或靶點研究中，可以有效的推進整個實驗研究的進展，方便與開展機制學以及方法學的研究，讓實驗更上一層樓！

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參考文獻：
[1] Indeglia A, et al. An African-Specific Variant of T P53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression. Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.