Revvity小動(dòng)物活體光學(xué)成像技術(shù)已在生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床前醫(yī)學(xué)研究及藥物 研發(fā)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。其中脂肪代謝研究是一個(gè)新興的熱點(diǎn)領(lǐng)域。將活體光學(xué)成 像技術(shù)應(yīng)用于脂肪代謝研究的主要方向是研究某個(gè)基因與脂肪代謝的關(guān)系及建立相關(guān) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型篩選參與脂肪代謝的化合物，實(shí)現(xiàn)方式包括：1、在小鼠體內(nèi)將熒光素 酶的基因重組到感興趣的脂肪代謝相關(guān)的基因啟動(dòng)子的下游，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠，利用該 模型可完成多種脂肪代謝相關(guān)信號(hào)通路、化合物作用等研究；2、在體外載體中將熒光 素酶的基因重組到感興趣的脂肪代謝相關(guān)的基因啟動(dòng)子的下游，然后利用水動(dòng)力學(xué)的方 式注射到小鼠體內(nèi)，載體會(huì)特異性的在肝臟表達(dá)；利用此模型同樣可進(jìn)行多種肝臟脂肪 代謝相關(guān)研究；3、利用生物發(fā)光探針進(jìn)行脂肪吸收的檢測(cè)；下面結(jié)合一些具體實(shí)例進(jìn) 行闡述：

一. 棕色脂肪研究

ThermoMouse 是一種新的轉(zhuǎn)基因報(bào)告小鼠，可允許研究人員實(shí)時(shí)地研究活體動(dòng)物中 的棕色脂肪活性。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在最近一期的《Cell Reports》雜志。棕色脂肪燃燒 能量的這種能力，其關(guān)鍵是解偶聯(lián)蛋白1（UCP1），在該小鼠模型中當(dāng)UCP1表達(dá)時(shí)， 熒光素酶隨之表達(dá)。因此通過生物發(fā)光檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)，則可實(shí)時(shí)檢測(cè)UCP1的表 達(dá)，因此該模型可鑒定藥物對(duì)肥胖的治療效果。

圖1：左，利用IVIS系統(tǒng)生物發(fā)光成像檢測(cè)ThermoMouse轉(zhuǎn)基因小鼠UCP1表達(dá)；(A) ThermoMouse報(bào)告 鼠中生物發(fā)光3D重構(gòu)信號(hào)，特定熒光素酶信號(hào)已經(jīng)表明體脂類型；(B)室溫下熒光素酶定量結(jié)果：脂肪、骨 骼肌,、肝臟、脂肪定量結(jié)果已經(jīng)用蛋白含量進(jìn)行校準(zhǔn)；(C) B中小鼠不同組織UCP1蛋白表達(dá)分；.(D) 28℃ 飼養(yǎng)條件下小鼠發(fā)光成像，隨后9C℃飼養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行生物發(fā)光成像；(E) D中小鼠定量結(jié)果(n = 9)；(F)D 中小鼠 Ucp1 mRNA 表達(dá)分析；(G)F中 UCP1 肩胛間棕色脂肪表達(dá)分析；(H) 生理鹽水或化合物CL-316， 243 處理1 天 (急性) 或者 4 天 (慢性)后生物發(fā)光成像；(I) H小鼠中UCP1 在棕色脂肪中的表達(dá)分析.(J) 生理鹽水或化合物CL-316，243 處理四天后，腹股溝白色脂肪成像；(K)小鼠腹股溝白色脂肪中UCP1蛋 白表達(dá)。Galmozzi et al., 2014, Cell Reports 9, 1584–1593

二.實(shí)時(shí)檢測(cè)脂肪酸在體內(nèi)的吸收

在一些生理或者病理?xiàng)l件下，脂肪比如游離脂肪酸的吸收程度會(huì)發(fā)生改變，這種現(xiàn) 象反映了重要的代謝過程，比如饑餓、寒冷以及心臟缺氧、腸道吸收障礙等一些病理狀態(tài)會(huì)激活棕色脂肪。同樣，F(xiàn)FAs（游離脂肪酸）的過多吸收與骨骼肌胰島素耐受性、心 肌疾病、脂肪肝以及心臟、肝臟的脂肪毒性有關(guān)。此外，F(xiàn)FA/脂質(zhì)流量可以被藥物干預(yù)， 例如在格列酮類抗糖尿病治療中，會(huì)增加 FFA 的吸收和在脂肪細(xì)胞的滯留。改變脂肪 酸的吸收和利用也可能是某些藥物帶來的副作用，比如抗癌藥物阿霉素，就會(huì)導(dǎo)致心臟 代謝的改變。因此對(duì)脂肪酸吸收的變化進(jìn)行定量定位的研究不僅對(duì)生物功能學(xué)研究有重 要意義，對(duì)于疾病的診斷、治療方法評(píng)價(jià)以及藥物開發(fā)同樣意義重大。因此在此研究中 利用生物發(fā)光技術(shù)來實(shí)時(shí)檢測(cè)脂肪酸的脂質(zhì)流量。研究結(jié)果表明，其設(shè)計(jì)的生物發(fā)光探 針 FFA-SS-luc 結(jié)合熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠，能夠很好的評(píng)價(jià)脂肪酸的吸收，同樣建立肝 臟生物發(fā)光轉(zhuǎn)基因小鼠能夠更好的評(píng)價(jià)肝臟脂肪的代謝情況。

圖1.在體內(nèi)生物發(fā)光檢測(cè)脂肪酸吸收的原理：首先小鼠為熒光素酶轉(zhuǎn)基因小鼠(FVB-luc+小鼠，熒光素酶在 actin 啟動(dòng)子下表達(dá))，F(xiàn)FA-SS-luc即游離脂肪酸和底物熒光素以二硫鍵相連，此生物發(fā)光探針注射小鼠 體內(nèi)后，熒光素會(huì)隨著脂肪酸的吸收被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)部，在細(xì)胞內(nèi)GSH的作用下，F(xiàn)FA與luc分離，隨后熒 光素與熒光素酶發(fā)生酶促反應(yīng)，產(chǎn)生光子，產(chǎn)生的光子穿透動(dòng)物體表后被高靈敏度的IVIS光學(xué)成像系統(tǒng)采 集到，生成小鼠生物發(fā)光的圖像。

圖3. FFA-SS-luc在小鼠體內(nèi)腸道、肝臟、脂肪組織、腎臟、心臟、骨骼肌的吸收成像。 左側(cè)：口服給藥方式，F(xiàn)FA-SS-luc在FVB-luc＋小鼠小腸內(nèi)的吸收(A)注射100μL FFA-SS-luc (20μM) 探針后 不同時(shí)間小鼠腹側(cè)成像；(b) 生物發(fā)光和μCT 疊加成像，注射50 μL of FFA-SS-luc (300 μM) 1 h后；(c)離體 腸道進(jìn)行成像，1、2、3分別是胃部、十二指腸和結(jié)腸；(d) FFA-SS-luc(right) 和對(duì)照l FFA-S-luc (left)注射 20 min 后腹部生物發(fā)光成像。 右側(cè)：尾靜脈注射方式， (a)注射 FFA-SS-luc 5min后成像； (b) 離體臟器成像(I) 白色脂肪(WAT), (II)肝 臟(III) 腎臟, (IV) 心臟 (V)骨骼肌；(c)腹腔注射FFA-S-luc 溶液((I/IV)、FFA-SS-luc (II/V)、FFA-SS-luc 與1 mg/kg 的β-腎上腺素拮抗劑 CL316243 (III/VI)；(d)棕色脂肪對(duì)C中不同探針吸收的動(dòng)力學(xué)曲線。

三.脂肪含量研究

減肥后脂肪量恢復(fù)的細(xì)胞過程具有普遍性，瘦素的 mRNA 水平與脂肪量有著密切 關(guān)系，因此瘦素的表達(dá)可以代表脂肪含量的改變。瘦素（Leptin，LP）是一種由脂肪組 織分泌的激素，人們之前普遍認(rèn)為它進(jìn)入血液循環(huán)后會(huì)參與糖、脂肪及能量代謝的調(diào)節(jié)， 促使機(jī)體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細(xì)胞的合成，進(jìn)而使體重減輕。為了進(jìn)一 步研究在不同條件下脂肪含量的變化，在此研究中建立了一種轉(zhuǎn)基因小鼠，在該小鼠體 內(nèi)重組的熒光素酶基因的表達(dá)受瘦素表達(dá)調(diào)節(jié)序列的調(diào)控，因此可以利用生物發(fā)光來非 侵入實(shí)時(shí)監(jiān)控瘦素的表達(dá)，從而衡量脂肪含量的變化。研究結(jié)果表明，1、該轉(zhuǎn)基因小 鼠瘦素的表達(dá)水平與熒光素酶活性高度一致，可以通過活體成像檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)來 真實(shí)反映瘦素的表達(dá)量；2、在禁食時(shí)瘦素的表達(dá)含量降低，而喂食后升高，另外在肥 胖小鼠中，瘦素的表達(dá)異常高；3、在禁食后，重新給予喂食6h后，瘦素表達(dá)增加，但 是此時(shí)脂肪并未合成，因此提示脂-殆盡的脂肪細(xì)胞在脂肪組織的滯留，在瘦素治療實(shí) 驗(yàn)中同樣驗(yàn)證了這一論點(diǎn)。

四.載體水動(dòng)力學(xué)注射后在肝臟表達(dá)的應(yīng)用

利用水動(dòng)力學(xué)注射方法，能讓表達(dá)載體穩(wěn)定存留在肝臟一段時(shí)間并進(jìn)行表達(dá)，例如 Dentin 等發(fā)表于 2007 年Nature 的一篇文獻(xiàn)報(bào)道了通過應(yīng)用熒光素酶基因標(biāo)記的cAMP 響應(yīng)元件（CRE-luc），研究了控制糖異生相關(guān)基因表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵分子開關(guān) TORC2/CRTC2 的作用。研究者通過水動(dòng)力注射法將CRE-luc表達(dá)載體經(jīng)尾靜脈注入正 常小鼠體內(nèi)，該表達(dá)載體將在一定時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定存留于小鼠肝臟中，使得研究者能夠借助 該表達(dá)載體觀測(cè)禁食及再進(jìn)食小鼠肝臟中的糖異生情況。在禁食小鼠中，禁食會(huì)導(dǎo)致血 糖濃度降低，從而激活胰高血糖素（Glucagon）所調(diào)控的糖異生信號(hào)通路，因此，在肝 臟中能夠觀測(cè)到由于CRE-luc的表達(dá)激活而出現(xiàn)的光信號(hào)；而當(dāng)小鼠再進(jìn)食后，由于血 糖濃度升高，而主要激活胰島素調(diào)控的糖酵解通路，因此，肝臟中CRE-luc的表達(dá)被抑 制，光信號(hào)消失；而當(dāng)用TORC2 siRNA處理禁食小鼠后，本該大量表達(dá)的CRE-luc表 達(dá)被抑制（減弱的光信號(hào)），說明TORC2在糖異生相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。 水動(dòng)力注射是非常成熟的方法，在IVIS光學(xué)成像系統(tǒng)國內(nèi)用戶中，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院詹 林盛研究員就利用水動(dòng)力學(xué)模型開展了一系列圍繞肝臟疾病的研究，例如丙型肝炎、肝 臟毒物代謝等，已經(jīng)成功建立了多種小鼠肝臟熒光素酶調(diào)控模型，在此類研究中有著豐