非天然氨基酸（ncAAs）是一類不受遺傳密碼子約束的特殊氨基酸，它們具有空間構型和化學性質，通過將它們精準地結合到蛋白質中，我們可以為蛋白質賦予新的化學、物理和生物活性。近年來，隨著生物技術和醫藥領域的快速發展，非天然氨基酸在生物學研究、藥物開發以及醫學診斷等方面展現出巨大的應用潛力。無細胞蛋白質表達(CFPS)作為一種創新的蛋白質表達平臺，極大的促進了人工蛋白質的表達，通過整合ncAAs，開發了許多靈活的方法，可顯著提高ncAAs的整合效率。

今天就和大家分享Front Bioeng Biotechnol期刊上名為“Emerging Methods for Efficient and Extensive Incorporation of Non-canonical Amino Acids Using Cell-Free Systems”的文獻。

無細胞蛋白質合成（CFPS）已成為在特殊應用中生產重組蛋白質的有效方法。通過消除細胞膜屏障和細胞活力約束，CFPS比體內蛋白質表達有明顯的優勢：1.CFPS的開放性，使得研究人員可以精確地操縱系統中分子；2.無需考慮細胞活性，有毒試劑和難以表達的蛋白質可以在CFPS中使用，甚至可以應用一些沒有生物相容性的反應條件；3.無需使用活細胞，生物安全可以得到保證。因為CFPS系統的這些特點讓其在ncAA整合中也具有顯著優勢，包括能處理有毒ncAAs、簡化后續反應流程以及避免細胞內整合的限制等。

然而ncAAs在CFPS中的整合過程會受到內生競爭影響，為了精確合并ncAAs，需重新分配特殊密碼子。雖然研究人員已對終止密碼子和有義密碼子進行了重新分配，但ncAAs復合物與內源性生物分子間的密碼子競爭仍會導致蛋白質錯誤或截斷。

圖1:CFPS系統制備和ncAAs合并中的內源競爭的示意圖

密碼子的競爭，會嚴重影響ncAAs整合的效率。目前，消除競爭的方法包括基因組工程、蛋白質消除、tRNA操作和氨基酸替代。

圖2:消除ncAAs競爭的不同策略

1.基因組工程

2.蛋白質消除策略

由于開放式反應環境可以直接控制，CFPS系統相比于體內翻譯系統更靈活。各種消除競爭策略只有在CFPS系統中才有可能。其中從CFPS系統中消除蛋白質的競爭是一個重要的消除策略，通過操縱蛋白質水平來保持對細胞生長至關重要的蛋白質活性，同時從CFPS系統中去除可能產生競爭的蛋白質。

CFPS系統中的蛋白質消除策略對于提高蛋白質合成效率和控制產物純度至關重要。通過選擇性去除或失活特定蛋白質，如RF1，可以優化CFPS系統的性能，并促進nAAs的插入，從而擴展蛋白質的功能和應用范圍。這些策略的實施依賴于基因工程和蛋白質工程的進展，以及針對特定蛋白質的定制化消除方法的開發。

3.tRNA的操作

4.替換氨基酸

圖3:新型ncAA僅用于CFPS

圖4:體外氨基酰化方法與CFPS相結合

CFPS作為設計遺傳密碼的強大平臺，特別是其高效整合ncAAs的能力，可以通過基因組工程、肽釋放因子消除、tRNA操作和氨基酸替代等多種策略來優化人工蛋白質的合成效率和產量。這些策略使得多個密碼子可以被重新分配給不同的ncAAs，無需內源性競爭，為人工蛋白質合成提供了更大的靈活性。CFPS在多個新興領域如抗體藥物、蛋白質標記和肽基材料中的應用潛力巨大，特別是在酶活性改善方面的潛力，例如通過ncAAs的整合來模擬或增強酶的磷酸化、甲基化等關鍵修飾。研究人員可以通過選擇合適方法，將CFPS高效整合ncAAS中，并激發ncAAs技術和應用的未來突破。

綜上所述，CFPS在ncAAs方面具有廣闊的應用前景。隨著技術的不斷發展和完善，CFPS結合ncAAs將在藥物研發、材料科學、生物學研究和合成生物學等領域發揮越來越重要的作用。

目前珀羅汀生物基于自研無細胞蛋白表達（CFPS）平臺，推出非天然氨基酸定點插入蛋白表達服務！這標志著珀羅汀生物成為可以提供基于自主知識產權的CFPS系統，進行非天然氨基酸定點插入相關的設計、服務、生產解決方案供應商！