你知道如何去除重組蛋白的融合標簽嗎？來看看吧！

百歐博偉生物：由于基因工程技術的發展，人們可以自由地將各種基因進行隨意的進行組合，表達出多種功能的蛋白質。蛋白融合標簽技術作為 DNA 重組技術的代表，通過在基因水平上改造目標蛋白，產生含有融合標簽的重組蛋白，兼具了原有蛋白質的功能活性和融合標簽所的生理生化特性。隨著蛋白藥物的飛速發展，融合標簽技術被廣泛地應用于科研及醫藥工業領域，尤其在蛋白質分離純化、膜蛋白結構研究、蛋白質生化功能研究等方面有著重要作用。

雖然融合標簽具有十分多的優點，可以使蛋白的純化更加的快捷方便、能夠促進目的蛋白的正確折疊和可溶表達、利于蛋白質的表達和定位等；但是有時對目標蛋白也會造成不利影響。其主要表現在：①融合標簽可能會影響目標蛋白的構象。例如蛋白連接GST標簽后，雖然蛋白質的可溶性增加了，但是蛋白質構象卻發生了很大的變化。因此，在研究蛋白質結構時，需要移除融合標簽，排除融合標簽對蛋白質結構的影響；②融合標簽可能會抑制和影響目標蛋白的活性。例如，對用于癌癥治療的單抗 CC49 單鏈 Fv 片段(scFv)的研究表明，當多聚組氨酸標簽與 scFv 的 C 端相連接時，會對 scFv 部分抗原結合位點進行覆蓋，從而降低 scFv 對抗原的結合能力。

在研究蛋白質或酶的性質或功能時，往往需要考慮融合標簽的對其是否有影響。對于藥用蛋白質，融合標簽可能會對目標蛋白的藥效產生不利影響，此外還會對人體健康存在潛在影響，因而很有必要將融合標簽進行去除。

移除融合標簽最長常用的方法可分為：化學法、外切蛋白酶法、內切蛋白酶法和基于內含肽的自我剪切法。

一、化學法

化學方法移除多肽標簽所采取的基本策略為：在目標蛋白與融合標簽之間插入一個甲硫氨酸殘基，蛋白被誘導表達和純化后，用溴化氰或羥胺處理該融合蛋白，使目標蛋白與融合標簽在插入的甲氨酸殘基處斷裂，從而使標簽和目標蛋白分開。

溴化氰(CNBr)解法是多種化學法中最重要的也是見的方法。由Gross和witkop于1962年建立的，后人進行了系統研究，能專一裂解甲硫氨酸殘基的羧基端，產率達到85%。由于蛋白質中的甲硫氨酸含量一般都比較少，因此裂解后的肽段較少，新生成的肽段往往是大肽段。

化學法的優點：化學法具有效率高、耗時短、成本低等。缺點：所需的反應條件容易破壞目標蛋白的結構和功能，而且所使用的溴化氰等試劑具有毒性，此法不適合于藥用蛋白；如果目標蛋白含有內源甲氨酸殘基，會發生非特異性斷裂，導致目標蛋白被破壞；此外，化學法切割時容易產生副反應，會對一些氨基酸側鏈進行修飾從而改變目標蛋白本來的性質。

二、外切蛋白酶法

外切蛋白酶能夠從蛋白質的 N 端或 C 端開始，依次切除一個或幾個氨基酸殘基，直到遇到某種特定的氨基酸殘基才會停止切割。外切蛋白酶的種類包括氨基肽酶和羧基肽酶，分別可以切除蛋白的 N 端和 C 端的融合標簽，例如氨基肽酶M (APM)和羧肽酶 A和B(CPA和CPB)等。

對于外切蛋白酶法切除融合標簽應用中，代表性的是基于二肽氨基肽酶(DPPI，商品名為DAPase)的作用機理所提供的 TAGZyme 系統，用于去除 N 端的多聚組氨酸標簽。DAPase 能夠從蛋白質 N 端依次切除二肽，當蛋白的 N 端出現 Lys、Arg、Gln 殘基，或者在 N 端第2個或第3個氨基酸殘基是Pro時，切除反應終止，酶切完成。

外切蛋白酶的作用獨立于目標蛋白內部的序列，不會造成非特異性切割，幾乎可以適用于任何目標蛋白。外切蛋白酶完成酶切的時間相對較短，也降低了造成目標蛋白變性失活可能性。外切蛋白酶完成酶切所需酶量也少于內切蛋白酶的用量，不但減少了非特異性切割的風險，還降低了后續去除該酶的難度。

三、內切蛋白酶法

內切蛋白酶能夠識別蛋白質的特定氨基酸序列，并從該序列內部或附近的特定氨基酸殘基處進行切割。使用內切蛋白酶時的一般策略：①選擇合適的內切蛋白酶，注意目標蛋白內部有多余的酶切位點；②構建表達載體時，在融合標簽與目的蛋白之間引入內切蛋白酶識別序列；③構建質粒、導入宿主并誘導表達、分離純化重組融合蛋白；④內切蛋白酶對融合蛋白進行酶切；⑤再次純化，去除內切蛋白酶和融合標簽。

在利用內切蛋白酶去除融合標簽時，內切蛋白酶的特異性和酶切效率主要受 3 種因素影響：①內切蛋白酶固有的非特異性酶切。如 Factor Xa 和凝血酶通常具有第二切割位點，并且第二位點的切割效率會隨著反應條件的不同而變化。非特異性切割可以通過優化反應條件減少，但不能消除 ，因此在優化條件時，需要檢測切割后的產物，以確定目標蛋白產物的均一性；②目標蛋白的結構。當融合蛋白的酶切識別位點位于蛋白質三維結構的內部時，內切蛋白酶活性中心難以識別到該位點，致使酶切效率變低。如在使用腸激酶對處于聚集狀態的目標蛋白所含的多聚組氨酸標簽的切除時，只有使目標蛋白的腸激酶的切割識別位點暴露出來后，才能獲得較高的酶切效率。③溶液中化學成分對酶切活性會產生影響，如去垢劑。在純化跨膜蛋白時，通常需要加入去垢劑，可能會影響內切蛋白酶的酶切效率。

在利用內切蛋白酶切除融合標簽之后，通常需要將內切蛋白酶除去掉。因此在內切蛋白酶時，盡量選取含有親和標簽的內切蛋白酶，在酶切完成后，通過二次過柱使帶親和標簽的內切蛋白酶吸附在柱上，而目標蛋白則洗脫下來。

四、基于內含肽的自我剪切法

內含肽(intein)是前體蛋白中的一段插入序列，能夠自我催化蛋白質的剪接(protein splicing)，使自身從前體蛋白中切除，并將兩側的外顯肽(extein)連接形成成熟的蛋白。

相比于化學法，自我剪切法條件溫和，不會導致目的蛋白的變性。相對傳統的酶切法需要多次過柱純化（不僅需要分離融合蛋白還需除去蛋白酶及融合標簽），自我剪切法簡化了純化過程，節約了成本和時間。 此外，自我剪切法具有良好的特異性，一般只在剪接位點的氨基酸殘基上發生切割，避免了酶切法由于第二識別位點因素的存在發生的非特異性切割。但是自我剪切法在誘導剪切時需加巰基試劑，會影響目標蛋白的二硫鍵。

以上4 種方法各有利弊，需要綜合考慮目標蛋白的特性，以及標簽移除方法和實驗目的，選擇合適的方法。

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