美國塔夫斯大學 (Tufts University) 的研究人員們報道了一種熒光免疫標記單個 EV 用于 NTA-FL 的優化算法，使得基于NTA的單囊泡免疫標記和檢測與粒度分布和濃度分析更為精準。該算法可以有效地提高NTA檢測結果可信度，為更深入研究 EV 的功能和機制提供了強有力的工具。

在前期研究中，研究人員們發現傳統的利用NTA進行EV亞型分析的熒光/散射光比對方法會出現數據偏離的情況。通常情況，熒光 (FM) 曲線所圍繞的面積與散射光 (LSM) 曲線所圍繞成的面積的比值可以表示EV的純度。但是這些研究人員們在分析過程中發現，在測試1，2，4中（表1，圖1），FM（藍線)與LSM（紅線）的比值大于100%，表明EV純度大于100%，這顯然是不合理的，這種測試結果表明：

1. 熒光檢測過程中，可能出現了大量的假信號。

2. NTA 系統的技術限制導致 LSM 無法檢測到非常小的 EV 或折射率低的其他顆粒。散射光模式下EV檢測不全，有部分EV數據沒有檢測到，使得LSM面積偏小，從而導致比值大于100%。

3. 研究人員還發現，FM模式在50 nm以下的區域還有明顯的信號峰出現，而對比LSM模式，其在50 nm以下信號基本衰減為0，這可能也是造成比值大于100%的原因之一。具體而言，這可能是游離的熒光分子沒有充分去除，以及體系中游離的蛋白質被熒光分子標記，造成小尺寸分區中的熒光信號增強。

為了解決這種情況，研究人員們提出了兩種評估方法：

第一種方法是傳統的計算方法，即計算樣本中大于 50  nm的顆粒數量，并比較 FM 和 LSM 中的顆粒數量，得出 FM 與 LSM 之間的比例。（圖2b，c）

第二種方法是優化后的計算方法，計算兩種方法得到的粒度分布曲線之間的重疊區域，并將該區域與 LSM 中大于 50 納米的顆粒總數量進行比較，得出重疊區域比例。（圖2d）

在研究過程中，研究人員著重強調了他們對顆粒粒徑選取的取舍。為了更精確地分析 EV，研究人員將分析范圍縮小到 50-200 納米。之所以選擇這個范圍，是因為大多數 EV 的尺寸都在這個范圍內。此外，LSM對小于 50 納米的顆粒檢測能力有限，而大于 200 納米的顆粒則可能并非 EV。因此，將分析范圍縮小到 50-200 納米可以有效地排除其他類型的顆粒，提高分析結果的準確性。

圖2 基于NTA的免疫標記算法示意圖

表2 算法優化后不同樣本的熒光面積 (FM) 與散射光面積 (LSM) 比值（SA）

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