本文要點：膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（GBM）是最致命的原發(fā)性腦腫瘤之一，但其診斷和治療仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)。本文報道了中性粒細(xì)胞靶向的半導(dǎo)體聚合物納米治療平臺（SSPNiNO）用于小鼠模型中原位膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像引導(dǎo)的三模態(tài)治療。SSPNiNO是由兩種半導(dǎo)體聚合物分別作為NIR-II熒光探針和光熱轉(zhuǎn)換劑制成的。熱響應(yīng)一氧化氮（NO）供體和腺苷2A受體（A2AR）抑制劑共同整合到SSPNiNO中，以實現(xiàn)三重治療作用。SSPNiNO表面附著有中性粒細(xì)胞靶向配體，通過“特洛伊木馬”方式介導(dǎo)其有效遞送到原位GBM位點，從而實現(xiàn)高靈敏度的NIR-II熒光成像。在NIR-II光照下，SSPNiNO通過NIR-II光熱效應(yīng)有效地產(chǎn)生熱量，這不僅可以殺死腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD），還可以控制NO釋放以增強腫瘤ICD。此外，封裝的A2AR抑制劑可以通過阻斷腺苷-A2AR通路來調(diào)節(jié)免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，從而進(jìn)一步增強抗腫瘤免疫作用，顯著抑制原位GBM的進(jìn)展。本研究可以為NIR-II熒光成像引導(dǎo)的有效GBM治療提供一種具有累積治療作用的多功能治療納米平臺。

活體成像

圖1. 成像引導(dǎo)下原位GBM光熱NO免疫治療的納米診療方案

在這項研究中，構(gòu)建了一種基于半導(dǎo)體聚合物（SP）的納米治療平臺，將其用于NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM光熱NO免疫治療。中性粒細(xì)胞靶向配體唾液酸（SA）共價連接到納米治療平臺上（圖1a）提高GBM的靶向能力。中性粒細(xì)胞可以穿過BBB并滲透到膠質(zhì)瘤中，因此SA結(jié)合的納米治療平臺也可以穿過BBB，并通過結(jié)合到中性粒細(xì)胞表面來提高納米治療試劑向GBM位點的遞送效率。這些納米診療平臺包含兩個SP，分別在NIR-II激光照射下實現(xiàn)對GBM的NIR-II熒光成像以及進(jìn)行NIR-II PTT。產(chǎn)生的熱殺死了腫瘤細(xì)胞，并觸發(fā)了熱反應(yīng)性NO供體釋放NO，以實現(xiàn)PTT控制的氣體治療，通過誘導(dǎo)ICD效應(yīng)光敏GBM腫瘤。這種納米治療劑遞送腺苷2A受體（A2AR）抑制劑來調(diào)節(jié)GBM的免疫抑制微環(huán)境，進(jìn)一步增強抗腫瘤的免疫反應(yīng)。因此，NIR-II熒光成像引導(dǎo)的光熱NO免疫療法對GBM治療顯示出良好的效果。

圖2. 納米平臺NO和A2AR抑制劑釋放性能評價

為了研究制備的納米治療試劑的光熱性能，使用紅外熱像儀監(jiān)測了在1064nm激光照射下的納米顆粒溶液的溫度波動。SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO溶液的溫度在激光照射下迅速升高，并在照射6分鐘后達(dá)到峰值（55°C）（圖2a）。這些納米粒子的加熱和冷卻曲線相似，表明它們具有一致的光熱性能。納米治療的光熱效應(yīng)表現(xiàn)出對納米粒子濃度和激光功率強度的依賴性。在激光照射6分鐘后，SSPNiNO溶液的溫度分別升高到41.9、55.0和66.9°C，激光功率強度分別為0.5、1.0和1.5 W cm-2（圖2b）。當(dāng)功率強度設(shè)置為1.0 W cm-2時，SSPNiNO溶液的溫度分別在12.5、25、50和100µg mL-1的濃度下升高到32.2、43.0、55.0和65.5°C（圖2c）。在NIR-II激光器開啟/關(guān)閉的5個周期內(nèi)，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO的加熱和自然冷卻曲線幾乎沒有變化（圖2d），表明它們具有良好的光熱穩(wěn)定性。這些納米粒子的光熱轉(zhuǎn)換效率約為57.4%（圖2e）。

光熱觸發(fā)S-NO鍵斷裂后，熱響應(yīng)性NO供體可以釋放NO。使用NO熒光探針確認(rèn)激光照射后NO的產(chǎn)生。NIR-II激光照射導(dǎo)致NO熒光探針的熒光強度顯著增加，這種增強的幅度與照射持續(xù)時間呈正相關(guān)（圖2f）。通過Griess試驗定量研究了光熱觸發(fā)的NO釋放。在沒有激光照射的情況下，NO的釋放可以忽略不計，但這取決于激光功率的強度和激光照射下納米粒子的濃度。0.5 W cm-2的激光不足以引發(fā)NO釋放，而與1.0 W cm-2于的激光相比，1.5 W cm-2的激光可以引發(fā)更多的NO釋放（圖2g）。在相同的激光照射條件下，SSPNiNO的濃度對NO釋放量有正比影響（圖2h）。還對A2AR抑制劑的釋放進(jìn)行了評估，結(jié)果表明約60%的藥物可以在24小時內(nèi)釋放（圖2i）。

圖3. 原位GBM腦靶向效果評價及NIR-II熒光成像

使用原位GBM模型評估了納米治療診斷藥物的體內(nèi)腦靶向能力。從原位GBM的小鼠中提取大腦。與對照組和SPNiNO處理的小鼠相比，SSPNNO和SSPNiNO處理的小鼠的腦熒光強度顯著升高（圖3a，b）。此外，在腫瘤部位觀察到熒光信號。提取的大腦也被切成切片進(jìn)行免疫熒光染色。盡管在SPNiNO治療組的大腦中也可以檢測到熒光信號，但在SSPNNO和SSPNiNO治療組的腦中檢測到信號（圖3c）。與SPNiNO處理組相比，SSPNNO和SSPNiNO處理組的熒光強度增加了約三倍。此外，Ce6標(biāo)記的SSPNNO和SSPNiNO的熒光信號與中性粒細(xì)胞的染色信號顯示出高度的共定位，這意味著中性粒細(xì)胞劫持在促進(jìn)靶向納米治療藥物的腫瘤積聚中起著至關(guān)重要的作用。

使用納米治療儀驗證了原位GBM的NIR-II熒光成像（圖3d）。全身給藥后，GBM位點的熒光逐漸升高，SSPNNO、SPNiNO和SSPNiNO注射的小鼠在24小時時也達(dá)到峰值（圖5e）。此時，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的GBM位點信號比注射SPNiNO的小鼠強得多。定量分析顯示，與注射SPNiNO的小鼠相比，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠原位GBM位點的NIR-II熒光強度增加了約2.0倍（圖3f）。這驗證了使用SSPNNO和SSPNiNO對原位GBM進(jìn)行靶向NIR-II熒光成像的可能性。

圖4. 小鼠原位GBM的體內(nèi)療效評價

原位C6-GBM攜帶Balb/c小鼠模型已用于體內(nèi)抗腫瘤作用評估。使用原位螢光素酶（Luc）-C6-GBM小鼠模型評估了納米治療劑的體內(nèi)抗腫瘤療效（圖4a）。用NIR-II激光照射原位GBM位點以介導(dǎo)體內(nèi)抗腫瘤治療，并記錄腫瘤的溫度。在NIR-II照射10分鐘后，注射SSPNNO和SSPNiNO的小鼠的腫瘤溫度升高了≈27.0°C，比NIR-II激光照射下注射SPNiNO的小鼠高10°C。如圖4b所示，與對照組相比，注射SSPNiNO和NIR-II激光照射（10分鐘）顯示出顯著的腫瘤生長抑制作用，這可以從腫瘤部位Luc信號強度的顯著降低中得到證明。相比之下，SPNiNO+激光和SSPNNO+激光僅顯示出部分抑制作用。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組腫瘤部位的生物發(fā)光強度總體上低于PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組（圖4c），表明基于納米治療的組合療法具有抗腫瘤療效。SSPNiNO+激光組在治療18天后，腫瘤部位的生物發(fā)光強度。還通過測量小鼠的存活時間來評估抗GBM的療效。在對照組中，C6-GBM模型的中位生存期僅為23天，而游離A2AR抑制劑治療將中位生存時間略微增加到24天（圖6d）。相比之下，SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組的存活時間延長。在用NIR-II激光照射SPNiNO和SSPNNO后，60%的攜帶GBM的小鼠在接種腫瘤38天后仍然存活。SSPNiNO+激光組在整個觀察期內(nèi)，所有攜帶GBM的小鼠均存活。攜帶GBM的小鼠的體重在腫瘤生長過程中逐漸下降。SSPNiNO+激光組的體重減輕最小，表明其抗GBM療效。

組織學(xué)染色分析以進(jìn)一步研究抗GBM療效。在PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組顯示出完整的腫瘤細(xì)胞形態(tài)，沒有壞死（圖4e）。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組腫瘤明顯消融，這些組中檢測到腫瘤細(xì)胞壞死。SSPNiNO+激光組細(xì)胞壞死程度，腦內(nèi)幾乎未觀察到腫瘤細(xì)胞。Ki-67染色顯示癌癥細(xì)胞的增殖能力， SSPNiNO+激光組的信號最弱（圖4e）。結(jié)果表明，SSPNiNO在NIR-II激光照射下可以達(dá)到的抗GBM療效。

圖5. 體內(nèi)ICD誘導(dǎo)和腺苷代謝評估

研究治療后的ICD效果。在SPNiO+激光、SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組中，綠色熒光信號相比對照組顯著增加（圖5a）。在SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組中，與PBS組相比，HMGB1熒光強度分別增加了1.8倍和2.2倍（圖5b）。SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組的CRT染色信號強度分別增加了6.1倍和7.4倍（圖5c）。因此，與PBS組相比，SSPNO+激光組腫瘤中的ATP水平分別增加了1.8倍和2.2倍（圖5d）。然而，SSPNiNO和游離A2AR抑制劑組的ATP水平?jīng)]有顯著升高。

ATP可以在腫瘤微環(huán)境中被外核苷酸酶水解為免疫抑制腺苷，可以通過作用于各種免疫細(xì)胞上表達(dá)的A2AR，發(fā)揮免疫抑制作用。與PBS對照組相比，SSPNO+激光和SSPNiNO+激光組的腫瘤中腺苷水平分別增加了約1.4倍和1.6倍（圖5e）。免疫熒光染色用于驗證腺苷免疫抑制腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié)。這揭示了這些納米治療劑釋放A2AR抑制劑以阻斷腺苷與A2AR的結(jié)合（圖5f）。NIR-II PTT和NO氣體治療觸發(fā)了腫瘤細(xì)胞的ICD，這可以將冷GBM轉(zhuǎn)化為熱表型，以改善效應(yīng)T細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤。此外，A2AR抑制可以逆轉(zhuǎn)腺苷對浸潤T細(xì)胞的免疫抑制作用，從而協(xié)同增強免疫反應(yīng)，提高抗腫瘤療效。

圖6. 體內(nèi)抗腫瘤免疫反應(yīng)的評估

為了驗證體內(nèi)增強的免疫反應(yīng)，研究了脾臟、引流淋巴結(jié)和腫瘤中的免疫細(xì)胞。如圖6a所示，在各種治療方案后，引流淋巴結(jié)中樹突狀細(xì)胞(DCs)的百分比有所增加。在SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組中，DCs百分比分別增加到17.8%、16.8%和22.1%（圖6b）。在SSPNiNO+激光組中觀察到CD4 T細(xì)胞（33.4%）（圖6d）。同樣，在應(yīng)用納米治療和NIR-II激光照射后，CD8 T細(xì)胞水平顯著上升（圖6e，f）。值得注意的是，SSPNiNO+激光組的DC、CD4 T細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞總體上高于SSPNNO+激光組，這表明A2AR抑制劑對全身免疫功能具有調(diào)節(jié)作用。

還對原位GBM腫瘤進(jìn)行了免疫熒光CD4、CD8和Foxp3染色，以評估局部免疫反應(yīng)。SPNiNO+激光、SSPNNO+激光和SSPNiNO+激光組與PBS、游離A2AR抑制劑和SSPNiNO組相比，CD4和CD8的熒光信號明顯更強（圖6g），在SSPNO+激光、SPNiNO+激光和SSPNiNO+激光組中，F(xiàn)oxp3染色信號減弱。與對照組相比，SSPNO+激光、SSPNiNO+激光和SSPNiNO+激光的Treg細(xì)胞分別減少了56.0%、75.0%和93.0%（圖S35，支持信息）。這些結(jié)果表明，在SSPNiNO+激光組的原位GBM腫瘤中，CD4和CD8T細(xì)胞，但Treg細(xì)胞，表明免疫效果。NIR-II PTT和NO氣體治療的組合誘導(dǎo)了增強的ICD效應(yīng)，以激活免疫反應(yīng)，與A2AR抑制劑協(xié)同作用，實現(xiàn)免疫反應(yīng)增強。

在本研究中，構(gòu)建了含有兩種SP，一種熱反應(yīng)性NO供體和A2AR抑制劑的中性粒細(xì)胞靶向納米治療平臺（SSPNiNO），用于NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM聯(lián)合治療。SSPNiNO的表面被一種中性粒細(xì)胞靶向配體修飾，這使得它們能夠粘附到中性粒細(xì)胞上，穿過BBB，并有效遞送到原位GBM位點。兩種SP的摻雜實現(xiàn)了NIR-II熒光成像和PTT。在NIR-II激光照射下，SSPNiNO可以將光能轉(zhuǎn)化為熱量，導(dǎo)致局部溫度升高，熱響應(yīng)性NO供體釋放NO。因此，在將SSPNiNO尾靜脈注射到原位攜帶GBM的小鼠體內(nèi)后，NIR-II激光可以遠(yuǎn)程觸發(fā)原位NO釋放和光熱效應(yīng)，從而誘導(dǎo)ICD效應(yīng)和免疫“冷”腫瘤向“熱”腫瘤的轉(zhuǎn)變。此外，SSPNiNO遞送A2AR抑制劑以阻斷腺苷途徑的抑制，進(jìn)一步增強免疫效果以原位GBM。目前，這是使用聚合物納米診療平臺，在NIR-II熒光成像引導(dǎo)的原位GBM PTT-NO-免疫治療中的開創(chuàng)性研究。

參考文獻(xiàn)

Liu J, Cheng D, Zhu A, et al. Neutrophil‐Targeting Semiconducting Polymer Nanotheranostics for NIR‐II Fluorescence Imaging‐Guided Photothermal‐NO‐Immunotherapy of Orthotopic Glioblastoma[J]. Advanced Science, 2024: 2406750.