單B細(xì)胞篩選技術(shù)可以利用免疫動物的單個B細(xì)胞快速生成mAb，是獲得天然抗體庫的有力技術(shù)。其中，mAb的重組生產(chǎn)通常是用動物細(xì)胞（如CHO和HEK 293）瞬時表達系統(tǒng)進行的，而動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染和表達至少需要3~5天，這極大限制限制了抗體篩選速度。

無細(xì)胞蛋白表達（CFPS）為mAb表達提供了一種新方式。該技術(shù)通過將細(xì)胞內(nèi)的RNA聚合酶、核糖體及轉(zhuǎn)錄翻譯輔助因子等合成蛋白所需要的分子機器提取出來，并輔以核苷酸、氨基酸、能量物質(zhì)及基因模板，在沒有活細(xì)胞參與的體外直接合成蛋白質(zhì)。

CFPS在高通量重組蛋白表達方面相比體內(nèi)表達方法具有顯著優(yōu)勢：

圖1 哺乳動物細(xì)胞表達篩選與CFPS高通量篩選流程示意圖

圖2 利用CFPS從單B細(xì)胞中快速篩選單克隆抗體的Ecobody技術(shù)

研究人員從用滅活副溶血性弧菌免疫的兔子的幾毫升血液中采集6.8×106個淋巴細(xì)胞，用ER追蹤器對細(xì)胞進行染色，并通過熒光激活細(xì)胞分選（FACS）收集到約2.0×104個細(xì)胞顯示強熒光的細(xì)胞。隨后，將涂有滅活副溶血性弧菌的磁珠加入細(xì)胞混合物中，用磁鐵分離與抗原結(jié)合的約500個細(xì)胞，其中19個用于單細(xì)胞PCR。每10µL分離一個細(xì)胞到384孔板中，并在倒置相差顯微鏡下選擇和確認(rèn)細(xì)胞-磁珠復(fù)合物。

使用基因特異性引物和SuperScript IV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。第一次 PCR使用與信號肽(SP)序列和抗體基因恒定區(qū)退火的引物，第二次 PCR使用帶有后續(xù)Gibson組裝步驟所需尾巴的引物。

以上環(huán)節(jié)在第一天完成。

通過Gibson組裝將T7啟動子和終止子與抗體基因結(jié)合，然后通過PCR擴增DNA片段，用于無細(xì)胞蛋白合成。

為了增強Hc和Lc的正確配對，研究人員還開發(fā)了一種名為“Zipbody”的改良Fab形式。即設(shè)計亮氨酸拉鏈(LZ) LZA和LZB，分別融合在Hc和Lc的C端。此外，還在N端添加短肽序列標(biāo)簽Ser-Lys-Ile-Lys(SKIK)，以提高蛋白表達水平。

隨后，使用DsbC和氧化谷胱甘肽（GSSG）通過CFPS表達帶有SKIK標(biāo)簽的Zipbody。

圖3 Ecobody技術(shù)獲得的mAb的ELISA評估

珀羅汀生物CFPS抗體表達案例一

圖4 某IgG與Fab片段SDS-PAGE圖及其ELISA活性（CFPS）

珀羅汀生物CFPS抗體表達案例二

圖5 某兩個VHH（左）與scFv（右）的SDS-PAGE圖（CFPS）