CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression

Subject terms: Orthodontics, Cell signalling

正畸治療是通過正畸牙齒移動（OTM）矯正咬合不正。OTM 是一種基于壓力-張力理論的機械生物學過程。壓力側的骨吸收是限速步驟，破骨細胞活化在骨代謝中起決定性作用。破骨細胞來源于單核細胞/巨噬細胞造血前體細胞，最終分化為成熟的破骨細胞。在正畸力刺激下，牙周成纖維細胞和成骨細胞釋放出一系列細胞因子，間接調節破骨細胞分化。

研究表明，機械刺激可以通過機械敏感受體（包括機械敏感離子通道和細胞粘附分子）直接調節破骨細胞分化。G 蛋白偶聯受體（GPCRs）是位于細胞膜表面的受體大家族，與破骨細胞分化和成熟密切相關。GPCRs 可以感知機械力并參與細胞內生物過程。然而，GPCRs 是否通過感應機械力參與破骨細胞生成仍是未知數。

CD97，也被稱為ADGRE5，是一種粘附類G 蛋白偶聯受體（aGPCR），這種分子在免疫系統疾病和上皮細胞衍生的惡性腫瘤中的作用已被充分證明，但最近，CD97 的機械感應功能引起了越來越多的關注。然而，CD97 在牙周組織中的表達尚未見報道。此外，正畸力是否會改變 CD97 表達仍不清楚，CD97 是否調節破骨細胞分化或參與 OTM 也尚未闡明。

基于此，河北省口腔醫學重點實驗室及國家口腔醫學中心（四川大學華西口腔醫院）的聯合團隊在一項研究中，使用 OTM 和靜態加壓應用模型探索了 CD97 表達與破骨細胞分化之間的關系。CD97 被確定為抑制破骨細胞分化和 OTM 的潛在機械感應分子。這些發現將有助于理解 OTM 的機制，并為加速牙齒移動提供潛在的治療靶點。研究成果發表在  International Journal of Oral Science  期刊題為“CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression”。

首先，分別分析了來自牙周組織和牙槽骨的單細胞 RNA 測序（scRNA-seq）數據，發現巨噬細胞亞群存在于牙周組織和牙槽骨中，CD97 在兩者的單核細胞/巨噬細胞簇中高度表達。

為了研究機械力對 CD97 表達的影響，將小鼠巨噬細胞系 RAW264.7 細胞暴露于 1 g/cm2 的靜態壓縮 2 小時（圖1 a）。Piezo1 的 mRNA 表達上調，表明壓縮力施加成功（圖1 b）。與對照組相比，CD97 mRNA 表達上調，而其他成員如 Gpr126、Gpr133 和 Gpr114 的表達下調。

此外，還檢測了 CD97 在不同受力和時間下的 mRNA 表達水平，發現其表達在 1 g/cm2 和 2 g/cm2 壓縮力刺激2 小時下以力依賴性方式上調（圖1 c）。在刺激的早期階段（1、2、4 h），靜態壓縮應用顯著增強了CD97 mRNA的表達（圖1 d）。通過活性染色將 1 g/cm2 壓縮力持續4 小時確定為最佳壓縮條件。TRAP染色用于觀察和評估破骨細胞生成（圖1 e），破骨細胞的數量（圖1 f）和 TRAP-陽性細胞面積的百分比（圖1 g）在壓縮負荷和 RANKL 誘導的破骨細胞生成 7 天后顯著降低。

通過SEM 評估破骨細胞的骨吸收功能（圖1 h），與對照組相比，吸收陷窩（resorption pit）形成的數量（圖1 i）和面積（圖1 j）顯著降低。免疫熒光染色證實，靜態壓縮后壓縮負荷上調了 CD97 表達（圖1 k、l）。這些數據表明，靜態壓縮上調單核細胞-巨噬細胞中 CD97 的表達并抑制破骨細胞生成。

圖1    靜態壓縮上調單核細胞-巨噬細胞中 CD97 的表達并抑制破骨細胞生成。

接下來，為了探討 CD97 在正畸壓縮下牙周組織巨噬細胞中的表達，實驗建立了 OTM 模型，與第3天相比，第7天OTM距離顯著增加。通過 TRAP 染色，發現破骨細胞的數量從第 0 天到第 7 天增加。以F4/80分子為巨噬細胞標志物，檢測其在小鼠牙周組織中的表達，CD97+ F4/80+ 巨噬細胞的免疫熒光共定位顯示，第 3 天牙周組織中陽性細胞增多。CD97+ F4/80+ 巨噬細胞的數量逐漸減少，與OTM距離呈負相關。這表明，在早期正畸力負荷期間，CD97 在牙周組織巨噬細胞中的表達增加。

為了確定 CD97 在破骨細胞形成中的功能，特異性敲低 RAW264.7 細胞中的 Cd97 mRNA。TRAP 染色表明，CD97 的敲低刺激了破骨細胞的分化（圖2 a、b）。CD97 的缺失促進了吸收陷窩的形成（圖2 c、d）。在 CD97 敲低組中，偽足小體肌動蛋白環（Podosome actin Belt-）陽性破骨細胞的大小和數量增加（圖2 e、f）。此外，CD97 的敲低上調了與破骨細胞分化相關的基因的表達（圖2 g-j）。

為了確定單核細胞-巨噬細胞中的 CD97 對機械負荷的感應，將RAW264.7 細胞在 CD97 敲低后暴露于靜態壓縮，1 g/cm2 的靜態加壓負荷4 小時后抑制破骨細胞的形成和吸收。敲低 CD97 部分恢復了在壓縮下的破骨細胞生成（圖2 a、b）。與此一致，破骨細胞吸收功能（圖2 c-f）和破骨細胞分化相關基因被恢復（圖2 g-j）。這些結果表明，CD97 可能是破骨細胞分化過程中重要的機械敏感受體。

圖2     CD97 介導破骨細胞分化中的機械轉導。

為了確定 CD97 在壓縮負荷下抑制破骨細胞分化的機制，對轉染陰性對照 shRNA（LV-shNC）和 CD97 shRNA（LV-shCD97）的 RAW264.7 細胞進行了 RNA 測序分析。結果表明，396 個基因上調，176 個基因下調。GO分析顯示，上調的基因集在 ERK1 和 ERK2 級聯反應中富集。KEGG分析顯示，在壓縮刺激下，CD97 敲低的 RAW264.7 細胞中，Rap1 信號通路受到抑制，Rap1a 的表達下調。qRT-PCR 同樣證實了 CD97 敲低下調了 Rap1 信號通路的代表性基因表達，如 Rap1a、Epac1 和 Adcy6。

由于 Rap1 的活化通過抑制 ERK 通路在調節細胞功能中起重要作用，而ERK通路是破骨細胞分化所必需的，因此檢測了巨噬細胞中 Rap1a 和 ERK 的蛋白水平。CD97 敲低下調 Rap1a 水平并上調磷酸化 ERK 表達。在壓縮刺激下，CD97 和 Rap1a 蛋白水平升高，磷酸化 ERK 表達降低。CD97 的敲低部分恢復了壓縮力下磷酸化的 ERK 表達。這表明，Rap1a/ERK 信號通路介導 CD97 在壓縮刺激下對破骨細胞分化的影響。

最后，為了確定 Rap1a/ERK 信號是否參與機械力刺激下的破骨細胞分化，對RAW264.7 細胞施加靜態壓縮并添加 Rap1a 抑制劑GGTI298。結果發現，靜態壓縮抑制破骨細胞的形成和活性，而GGTI298 恢復了壓縮下的破骨細胞的分化和活性（圖3 a-d）。Western blotting 顯示，磷酸化的 ERK 表達因壓縮而下調，并且在 GGTI298 處理后被部分逆轉（圖3 e）。

然后，實驗在 OTM 期間對小鼠單側第一磨牙施用GGTI298，發現GGTI298注射加速了牙齒移動（圖3 f、g），牙周韌帶中的 TRAP 陽性細胞也增加（圖3 h、i）。 這些結果表明，機械力通過 Rap1a/ERK 信號調節破骨細胞分化和 OTM抑制Rap1a 可以刺激破骨細胞分化并加速 OTM。

圖3    機械力通過 Rap1a/ERK 信號調節破骨細胞分化和正畸牙齒移動。

總之，該研究揭示了 CD97 是一種新型機械敏感的 aGPCR，使巨噬細胞能夠感知壓縮并將此信息與 Rap1a/ERK 信號整合以抑制破骨細胞生成和 OTM（圖3 j）。具體來說，CD97 在牙槽骨和牙周組織的單核巨噬細胞中表達。壓縮上調 CD97 表達并抑制破骨細胞分化。此外，CD97 介導的機械感覺及其下游 Rap1a/ERK 信號通路對于調節破骨細胞分化和阻礙早期牙齒移動至關重要。這種對壓縮如何影響破骨細胞分化的理解可能會對 OTM 中牙周組織的生物反應產生新的機制見解，并最終為正畸治療提供新的策略。

參考文獻：Wang W, Wang Q, Sun S, Zhang P, Li Y, Lin W, Li Q, Zhang X, Ma Z, Lu H. CD97 inhibits osteoclast differentiation via Rap1a/ERK pathway under compression. Int J Oral Sci. 2024 Feb 4;16(1):12. doi: 10.1038/s41368-023-00272-x. PMID: 38311610; PMCID: PMC10838930.

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