miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC

Keywords: MT: Non-coding RNAs; Notch; arterialization; endothelial cell; miR-342-5p; shear stress.

血管生成，是指從已有血管發展形成新的血管，涉及內皮細胞（ECs）的增殖、分化和遷移。在生長的血管新生芽融合后，內皮細胞獲得動脈表型并進一步成熟，最終形成一個穩定的分級血管網絡，通過動脈化的過程灌注組織。

遺傳程序和環境因素都參與 EC 動脈化，如血流誘導的剪切應力、血管內皮生長因子受體（VEGFR）信號和 Notch 信號。以往研究報道了 ECs 中 Notch 下游的 miRNAs，發現激活Notch 信號至少部分通過 miR-218-5p 下調 MYC 基因表達以抑制細胞周期進程，靶向異質核核糖檢查蛋白A1（HNRNPA1）和眼缺失同源物3（EYA3）。miR-342-5p 是另一種抑制 EC 增殖和血管生成的 Notch 下游 miRNA。研究證明，在 EC 中，miR-342 可以被層流剪切應力上調。然而，剪切應力對 miR-342 的上調是否由 Notch 信號介導，以及 miR-342 在通過 Notch 信號介導機械轉導以促進 EC 動脈化中的作用尚不清楚。

鑒于此，空軍軍醫大學基礎醫院韓驊教授/晏賢春副教授及西京醫院劉曉渭教授團隊合作在Molecular Therapy Nucleic Acids 期刊發表了題為“miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC”的研究成果。該研究評估了剪切應力、Notch 信號和 miR-342 之間的關系及其在促進 EC 動脈化中的下游機制。通過在確定流動條件下培養的 EC、新生視網膜血管生成和后肢缺血模型，miR-342 被鑒定為一種機械 miR，通過靶向 EYA3 減弱 MYC 表達來促進 EC 動脈化并改善血流灌注，從而穩定 MYC。這些結果提供的見解將有助于優化缺血性疾病的血管再生。

首先，使用體外層流對人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）施加15 dyn/cm2剪切應力持續12或24 h以研究miR-342是否對血流誘導的剪切應力（FSS）做出反應。與在靜態對照 HUVECs 相比，FSS 條件下miR-342 及其宿主基因 EVL 顯著上調。FSS 始終激活 Notch 信號，并上調 miR-342 和 EVL，這可以被 Notch 抑制劑（DAPT）消除。這表明，剪切應力通過激活 HUVECs 中 Notch 上調 miR-342 表達。基因集富集分析（GSEA）和熱圖分析顯示，在靜態培養的 HUVECs 中，miR-342 過表達上調了剪切應力相關基因特征，如 KLF2 和 KLF4。但miR-342 表達降低的 HUVECs 在FSS下無法平行排列，阻斷miR-342 在LSS下顯著下調 KLF4 和 KLF2 的表達。這些結果表明，miR-342 介導 ECs 對 FSS 的反應。

FSS 激活 Notch 信號，從而上調動脈標志物。與此一致的是，在 FSS 下過表達 miR-342 的 HUVECs 也表現出動脈標志物（包括EFNB2、GJA4、GJA5和HEY2）表達的顯著增加及靜脈標志物（包括EPHB4、NRP2和NR2F2）表達的減少，靜態對照組則呈現相反的效應。體內熒光原位雜交（FISH）染色顯示，miR-342 陽性信號主要位于腎臟、肝臟和肺組織的動脈中。這表明，miR-342 介導剪切應力對動脈基因表達增強的影響。

進一步利用Matrigel栓塞試驗檢測血管生成情況，免疫染色顯示，miR-342 顯著增加 EC 標志物 CD31 和動脈標志物 GJA4 或血管平滑肌細胞（vSMC）標志物 α-SMA 的共定位，表明動脈標志物表達和 vSMC 覆蓋率增加（圖1 A、B）。

在視網膜血管生成模型中，miR-342 水平也顯著增加。IB4 與 α-SMA 的免疫染色表明，伴隨著血管密度降低，miR-342 的上調顯著增加視網膜血管中的 α-SMA⁺ vSMC，表明 vSMC 覆蓋率增加，這是動脈化的標志（圖1 C）。qRT-PCR顯示，在注射 miR-342 的視網膜中動脈標志物表達增加，而靜脈標志物顯著降低。相比之下，玻璃體內注射 miR-342 拮抗劑顯著降低了 α-SMA⁺ vSMC 覆蓋率，而視網膜血管密度略有增加（圖1 D）。這些結果表明miR-342 在體內促進動脈化。

圖1    miR-342在體內增強EC動脈化。

接下來，評估了 miR-342 與 FSS 在 EC 動脈化調節方面的關系，發現阻斷 miR-342 部分消除了 FSS 誘導的動脈標志物上調，這表明，miR-342 介導 FSS 誘導的 ECs 中動脈標志物的上調。觸發 Notch 激活發現其在 mRNA 和蛋白質水平上上調動脈標志物并下調靜脈標志物，但敲低 miR-342 減弱了這些影響。值得注意的是，miR-342 的敲低通過 Dll4 觸發的 Notch 激活減弱動脈化。這些結果表明，miR-342 在 FSS 觸發的 Notch 激活下介導 EC 動脈化。

MYC 基因是一種原癌基因，它主要參與細胞分裂和增殖過程。Notch 活化通過抑制 MYC 依賴性代謝和細胞周期活動來促進 EC 動脈化。miR-342 過表達顯著抑制 MYC 調節因子和細胞周期進程相關基因。一致地，在轉染 miR-342 模擬物的 HUVECs 中，細胞周期進程減慢。這表明，miR-342 可能通過抑制 MYC 表達來減弱 EC 細胞周期進程。

進一步驗證 MYC 在 miR-342 誘導的 EC 動脈化中的作用，發現 MYC 表達在 FSS 和 Notch 激活下降低。同樣，miR-342 過表達顯著下調 HUVECs 中 MYC 的 mRNA 和蛋白水平（圖2 A、B），相比之下，miR-342 敲低上調了兩者水平（圖2 A、C），而阻斷miR-342 消除了 Notch 激活對 MYC 表達的抑制。這些結果表明，miR-342 通過被 FSS 觸發的 Notch 活化介導對 MYC 的抑制。

此外，MYC 過表達顯著促進了細胞周期進程（圖2 D、E），且消除了 miR-342 過表達誘導的 EC 動脈化，多種動脈標志物的 mRNA 和蛋白表達被抑制，而靜脈標志物的表達得到恢復（圖2 F、G）。這些結果證實 miR-342 通過抑制 MYC 增強動脈化。

圖2     MYC 過表達消除了 miR-342 誘導的 EC 動脈化。

生物信息學分析表明MYC不是miR-342的直接靶點，然而，通過蛋白磷酸酶2A（PP2A）去磷酸化Thr58和Ser62來增加MYC蛋白穩定性的EYA3的3'-UTR含有miR-342識別位點。進一步研究表明，EYA3 過表達消除了 miR-342 過表達誘導的 MYC 的 Thr58 磷酸化和 Ser62 去磷酸化，并增加了 HUVECs 中 MYC 蛋白水平。此外，EYA3 過表達消除了 miR-342 誘導的 EC 動脈化。這些結果表明，miR-342 通過直接靶向 EYA3 下調 MYC 來促進 EC 動脈化。

EC 動脈化是缺血性損傷后血管灌注的重要步驟。最后，為了評估 miR-342 是否可用于改善組織缺血后的血管灌注，實驗通過結扎小鼠建立了后肢缺血模型。結果顯示，miR-342 與其宿主基因Evl在結扎的股動脈中的表達顯著降低。FISH 染色進一步表明，結扎側 ECs 中 miR-342 的表達顯著降低（圖3 A）。然后，在多側肌肉注射 miR-342 激動劑，結果顯示，其在損傷后第 7 天和第 14 天顯著改善了血管灌注（圖3 B）。此外，在 CD31+ ECs 中，與未結扎組相比，結扎后 GJA4 表達以及 CD31+ ECs 和 α-SMA+ vSMCs 的共定位顯著下調，而 miR-342 注射顯著改善了下調的動脈化（圖3 C、D）。這些結果表明，局部 miR-342 注射可能通過增強缺血性疾病中的 EC 動脈化來促進血管灌注。

圖3    在后肢缺血模型中miR-342 促進 EC 動脈化并增加血流灌注。

圖4    圖形概要

miR-342-5p通過靶向EYA3抑制MYC，介導剪切應力和Notch激活對促進EC動脈化的影響，這在缺血性疾病的治療中具有潛力。

總之，該研究結果揭示了剪切應力和 Notch 信號介導的內皮動脈化的潛在機制，即 miR-342 充當介導剪切應力-Notch 信號軸的機械 miR，通過直接靶向 EYA3 下調 MYC 來促進內皮動脈化。因此，miR-342 可能是治療缺血性疾病的潛在靶點。

參考文獻：Zhang X, Sun J, Zhang P, Wen T, Wang R, Liang L, Yang Z, Li J, Zhang J, Che B, Feng X, Liu X, Han H, Yan X. miR-342-5p downstream to Notch enhances arterialization of endothelial cells in response to shear stress by repressing MYC. Mol Ther Nucleic Acids. 2023 Apr 4;32:343-358. doi: 10.1016/j.omtn.2023.03.022. PMID: 37128275; PMCID: PMC10148082

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