【微載體】

微載體指直徑在60-250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成，較傳統二維平面基質可提供更大的細胞貼附面積，另外，利用微載體可以實現貼壁細胞的懸浮培養并借助生物反應器實現貼壁細胞的規模化生產，節省人力、物力和空間。

據GIR (Global Info Research)調研，按收入計，2021年全球微載體收入大約1062.9百萬美元，預計2028年達到1321.3百萬美元，2022至2028期間，年復合增長率CAGR為 3.2%。調研預測顯示微載體的未來需求大規模擴增，但面對市場上琳瑯滿目的載體，我們如何進行選擇呢？

下面我們將從幾個方面進行簡單介紹，幫助大家對微載體細胞培養有更多了解。

【載體結構與材質】

① 結構：

通常分為固體微載體（實心微載體和多孔微載體）和液體微載體。

圖1：固體微載體的分類及優、劣勢分析（點擊查看大圖）

② 材質：

微載體的制造材料也是細胞培養中的?個關鍵因素，因為它對細胞有物理和化學作?，包括孔隙率、機械強度、營養物質的滲透性、尺?、密度和形狀【2】。

? 人工合成的高分子材料：

例如聚苯乙烯微載體、中空玻璃微載體、聚苯烯酞胺微載體等；

? 天然來源的高分子材料：

例如交聯明膠微載體、纖維素微載體、殼聚糖微載體、海藻酸、透明質酸等；

? 其他無機材料：

例如玻璃微載體等。

【貼壁依賴的動物細胞在微載體上貼壁、增殖和收獲】

① 微載體影響細胞貼附的因素【2】

（1）細胞與微載體的相融性

細胞與微載體的相容性主要與微載體基質表面的化學、物理性質相關。一般細胞在進入生理pH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于黏附貼壁，但培養液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。

市場上常見的傳統微載體采用的基本基質，如聚苯乙烯、葡聚糖、玻璃等聚合物為電中性的材質，無法支持細胞貼壁，因此通常修飾正電荷或化學鍵合，以促進具有不均勻表?負電荷分布的貼壁細胞的附著。?具有較?電荷密度的微載體被開發?于促進弱細胞系的細胞粘附（例如 Cytopore 1 和 2）。

? 微載體表面的化學修飾：

△ 將化學基團結合到載體表面是一種常見的方法（原理通過改變載體表面電荷的親水性或疏水性）如氨基、伯胺、叔胺和三?胺等基團等改變載體表面電性或羧基化、羥基化提高微載體親水性；

△ 引入含相關細胞貼附位點的蛋白，如：纖連蛋白、膠原蛋白和層粘連蛋白等。

（2）載體表面物理特征，包括形貌和粗糙度，如多孔或者實心。

（3）取決于細胞與微載體接觸的幾率

?載體、細胞的接種密度；

? 攪拌條件：較低的攪拌速度利于細胞的接種，而MSC更適合減速接種【2】

② 細胞在微載體表面的增殖的影響因素

影響細胞在微載體表面增殖或分化的因素很多，主要有三個方面。

（1）在細胞方面：如細胞群體、活性、狀態和類型。

（2）在微載體方面：如微載體表面的生化性能、吸附的大分子和離子；微載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢；表面物理特征如剛度和彈性模量、形貌等均會影響細胞的增殖或分化。文獻報道剛性表面剛度在34Kpa時會導致MSCs呈紡錘狀并向骨分化，表面為1Kpa的低剛度則促進了軟骨、脂肪、神經元分化，而中等表面剛度則促進向肌肉分化【2】。

（3）在培養環境中：如培養基組成、溫度、pH、氧以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件***，則細胞生長快；反之生長速度慢。

③ 貼壁依賴的動物細胞在微載體上的收獲：

容易收獲細胞或細胞制品是優秀微載體的一個關鍵指標，同時也是用戶選擇載體的關鍵指標之一。

目前市面上常規的傳統微載體主要采用聚苯?烯、葡聚糖、纖維素或玻璃等不可溫和降解的聚合物作為微載體的基本基質。因此在培養結束時，較難將細胞與微載體充分分離成為這些微載體在細胞收獲過程中需要突破的挑戰【2】。尤其市面上常規的微載體通過表面修飾增強了電荷，依靠電荷提供較強的細胞貼壁效果，這使得在細胞分離時需要較強的酶消化強度和時間，而且不能令細胞消化下來，如此導致較大的細胞損失和細胞損傷。

另一方面，不可降解的微載體與細胞均為固體物質，僅靠常規離心無法分離，需要額外的梯度離心或者過濾的方法將微載體去除以獲得細胞，增加了整個生產過程的成本和過程的復雜性，降低了細胞回收率和活性。更進一步的，所收獲的細胞用于治療存在安全隱患，因為微載體顆粒若無法得到有效去除，其殘留將導致后續細胞制品注射體內將引起血管堵塞或者異物排斥等安全性問題。

【應針對不同應用選擇適合的微載體】

綜上不難發現細胞能否在微載體表面附著生長并擴展取決于細胞的特性、微載體理化性質、培養基成分及培養條件。而微載體性能的優良與否是關鍵的因素，它不僅影響培養細胞的形態、貼壁率、生長速率、細胞密度以及是否容易收獲細胞或其分泌產物，乃至于產物的整個生產成本。

針對不同的細胞類型不僅要篩選合適的微載體，也需要合適的接種條件及培養條件，而對于大多數細胞培養研發和生產的企業來說，對各類型微載體的認識不是很***，在選擇過程中有很多關鍵的因素根本考慮不到。

目前華龕生物能夠提供基于不同細胞在微載體上從接種、培養，到體系放大和收獲等一整套解決方案。廣泛應用于細胞治療、病毒疫苗、基因工程和組織工程等領域。

【實例】

① 生物醫藥領域的微載體應用現狀——細胞治療領域

間充質?細胞的臨床應?需要數?億個細胞和?維平臺，這可能對擴?規模構成挑戰。

為了在細胞移植和組織?程應?中獲得可 擴展的未分化間充質?細胞數量，與?維培養相?，三維培養技術是?種更***的?法【2】。

例如：華龕生物利用原創3D TableTrix®W系列多孔可降解微載體、僅針對載體的裂解液結合自動化生物反應器和細胞收獲裝置可實現一次1010級別的間充質干細胞制劑產量。

② 生物醫藥領域的微載體的應用現狀——病毒疫苗領域(vero細胞)【3】

文中提出已經工業化的微載體技術為使用 Vero 細胞系生產病毒提供了一個強大的平臺，但實現更高的病毒生產力，該平臺面臨著一些挑戰。與生物工藝相比與其他動物細胞系相比，Vero 細胞密度仍然相對較低，一般不超過 107 個細胞/mL（圖3）。

文中給出的解決方案：

（1）更深入的研究：分析高細胞濃度下 Vero 細胞的狀態（代謝組學、轉錄組學和蛋白質組織學等方面充分的研究）。

（2）更合適得培養策略：實時的營分和待測物濃度檢測，并且及時的供給及排出【3】。

實際上，目前華龕已經實現使用3D TableTrix®V系列可高溫滅菌微載體，配合3D FloTrix®vivaSPIN 自動化生物反應器，在微載體4g/L~10g/L的條件下，連續培養一周的時間即可獲得1×107cells/mL的較高細胞培養密度。Vero細胞在微載體上，有較好的貼附能力，該細胞密度滿足于疫苗的大量生產并且已有相關研究數據顯示其產毒效率亦顯著高于傳統微載體（圖4）。

圖4：使用不同類型微載體培養Vero細胞產生的某病毒滴度對比

參考文獻

[1] Berry JM, Barnabé N, Coombs KM, Butler M. Production of reovirus type-1 and type-3 from Vero cells grown on solid and macroporous microcarriers. Biotechnol Bioeng. 1999 Jan 5;62(1):12-9. doi: 10.1002/(sici)1097-0290(19990105)62:1<12::aid-bit2>3.0.co;2-g. PMID: 10099508

[2] Chen AK, Reuveny S, Oh SK. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 2013 Nov 15;31(7):1032-46. doi: 10.1016/j.biotechadv.2013.03.006. Epub 2013 Mar 24. PMID: 23531528.

[3] Kiesslich S, Kamen AA. Vero cell upstream bioprocess development for the production of viral vectors and vaccines. Biotechnol Adv. 2020 Nov 15;44:107608. doi: 10.1016/j.biotechadv.2020.107608. Epub 2020 Aug 5. PMID: 32768520; PMCID: PMC7405825.

[4] Zhang Y, Na T, Zhang K, Yang Y, Xu H, Wei L, Xu L, Yan X, Liu W, Liu G, Wang B, Meng S, Du Y. GMP-grade microcarrier and automated closed industrial scale cell production platform for culture of MSCs. J Tissue Eng Regen Med. 2022 Aug 5. doi: 10.1002/term.3341. Epub ahead of print. PMID: 35929499.