大鼠氧化還原酶-1(NQO-1)ELISA試劑盒
(用于血清、血漿、細胞培養(yǎng)上清液和尿液生物體液內(nèi))
原理
本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 NQO-1 單抗包被于酶標(biāo)板上,標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 NQO-1與單抗結(jié)合,加入生物素化的抗大鼠NQO-1,形成免疫復(fù)合物連接在板上,辣根過氧化物酶標(biāo)記的Streptavidin與生物素結(jié)合,加入底物工作液顯藍色,zui后加終止液硫酸,在450nm處測OD值,NQO-1濃度與OD值成正比,可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中NQO-1濃度。
試劑盒組成(2-8℃保存)
酶標(biāo)板(Coated Wells) | 96孔 | 酶標(biāo)抗體工作液(Enzyme Conjugate) | 12ml |
10×標(biāo)本稀釋液(Sample Buffer) | 12ml | 20×濃縮洗滌液(Wash Buffer) | 50ml |
標(biāo)準(zhǔn)品(Standards):0.4mU/瓶 | 2瓶 | 底物工作液(TMB Solution) | 12ml |
*抗體工作液(Biotinylated Antibody) | 12ml | 終止液(Stop Solution) | 12ml |
準(zhǔn)備試劑與收集血樣
1. 收集標(biāo)本:血清、血漿(EDTA、檸檬酸鹽、肝素抗凝)、細胞培養(yǎng)上清液、組織勻漿、尿液等盡早檢測,2-8℃保存48小時;更長時間須冷凍(-20℃或-70℃)保存,避免反復(fù)凍融。血清、血漿標(biāo)本測定前用標(biāo)本稀釋液作1:20稀釋(取10ul,加標(biāo)本稀釋液190ul,稀釋20倍)。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品液配制:使用前加入0.5ml蒸餾水混勻,配成800mU/L的溶液。設(shè)標(biāo)準(zhǔn)管8管,每管加入標(biāo)本稀釋液200ul。在*管中加入800mU/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液200ul混勻后用加樣器吸出200ul,移至第二管。如此反復(fù)作對倍稀釋,從第七管中吸出200ul棄去。第八管為空白對照。
3. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋(示例:1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水)。
4. 洗滌液:用重蒸水1:20稀釋(示例:1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水)
檢測程序
1. 加樣:每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100ul,將反應(yīng)板充分混勻后置37℃120分鐘。
2. 洗板:用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次,向濾紙上印干。
3. 每孔中加入*抗體工作液100ul。將反應(yīng)板充分混勻后置37℃60分鐘。
4. 洗板:同前。
5. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
6. 洗板:同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul,置37℃暗處反應(yīng)15分鐘。
8. 每孔加入100ul終止液混勻。
9. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測吸光值。
結(jié)果計算與判斷
1. 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。
2. 以標(biāo)準(zhǔn)品400、200、100、50、25、12.5、6.25、0 mU/L為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上作圖,畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)NQO-1含量,再乘上稀釋倍數(shù)即可。
試劑盒性能
1. 靈敏度:zui小的NQO-1 檢測濃度小于3mU/L。
2. 特異性:可同時檢測重組或天然的大鼠NQO-1。不與大鼠其它細胞因子有交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10.6%。
注意事項
1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測樣品均建議做復(fù)孔,每次測定應(yīng)同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致度誤差及OD值錯誤地升高。
3. 板條開封后剩余板條要再封好,保持板條干燥。
4. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。
5. 本試劑盒僅用于科研,不能用于臨床診斷!
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