一、原理
在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導致細胞內發(fā)生機械損傷、電解質升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結條件下，能使細胞內水份在凍結前透出細胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
細胞復蘇時速度要快，使之迅速通過細胞zui易受損的－5～0℃，細胞仍能生長，活力受損不大。
目前常用的保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。
二、操作步驟
（一）凍存
1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。
2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。
3、沉淀加含保護液的培養(yǎng)，計數(shù)，調整至5×106/ml左右。
4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。
5、將凍存管口封嚴。如用安瓿瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂。
6、貼上標簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。
7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘〕→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。
注意：操作時應小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。
（二）復蘇
1、準備一個茶缸或1000ml的燒壞，內裝2/3杯37℃的溫水。
2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內融化。
3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。
4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。
5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。
6、加適當培養(yǎng)基后將細胞轉移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，第二天觀察生長情況。
三、試劑和器材
器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機等
試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑的培養(yǎng)基（即凍存液）
附：凍存液配制：
培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達5—20%。保護劑的種類和用量視不同細胞而不同。配好后4℃下保存。

DU145(前列腺癌細胞) 
Lncap(前列腺癌細胞) 
PC-3(前列腺癌細胞) 
MOLT-4(急性淋巴母細胞白血病細胞) 
5637(膀胱癌細胞) 
Raji(Burkitt's 淋巴瘤細胞) 
SCaBER(膀胱鱗癌細胞) 
NAMALWA(Burkitt's 淋巴瘤細胞) 
T24(膀胱移行細胞癌細胞) 
HuT78(T淋巴細胞白血病細胞) 
SW-13(腎上腺皮質腺癌細胞 ) 
SW-13(腎上腺皮質腺癌細胞 ) 
Dami(巨核細胞白血病細胞) 
OS-RC-2(腎癌細胞) 
MEG-01 
786-O [786-0](腎透明細胞腺癌細胞) 
786-O [786-0](腎透明細胞腺癌細胞) 
K-562(慢性髓原白血病細胞) 
K-562(慢性髓原白血病細胞) 
Hce-8693(盲腸腺癌細胞(未分化)) 
HEL299(紅白細胞白血病細胞) 
CW-2(結腸腺癌細胞) 
A-375 [A375](惡性黑色素瘤細胞) 
COLO-320(結腸腺癌細胞) 
A172(膠質母細胞瘤細胞) 
SW480 [SW-480](結腸癌細胞) 
SHG-44(膠質瘤細胞) 
Caco-2(結腸腺癌細胞) 
Caco-2(結腸腺癌細胞) 
U251(膠質瘤細胞) 
LS 174T(結腸腺癌細胞) 
SK-N-MC(神經(jīng)上皮瘤細胞) 
SK-N-MC(神經(jīng)上皮瘤細胞) 
BxPC-3(原位胰腺腺癌細胞) 
BxPC-3(原位胰腺腺癌細胞) 
KP-N-NS(腎上腺神經(jīng)母細胞瘤細胞(腦轉移)) 
AsPC-1(轉移胰腺腺癌細胞) 
AsPC-1(轉移胰腺腺癌細胞) 
U-2 OS(骨肉瘤細胞) 
U-2 OS(骨肉瘤細胞) 
GBC-SD(膽囊癌細胞) 
RD(惡性胚胎橫紋肌瘤細胞) 
RD(惡性胚胎橫紋肌瘤細胞) 
HCCC-9810(膽管細胞型肝癌細胞) 
A-673(橫紋肌瘤細胞) 
SMMC-7721(肝癌細胞) 
SMC-1(胸膜細胞瘤) 
QGY-7703(肝癌細胞) 
NCI-H446 [H446](小細胞肺癌細胞) 
QGY-7701(肝癌細胞) 
BEL-7405(肝癌細胞) 
NCI-H460 [H460](大細胞肺癌細胞0 
NCI-H460 [H460](大細胞肺癌細胞0 
BEL-7404(肝癌細胞) 
BEL-7402(肝癌細胞) 
QG-56(肺扁平上皮癌細胞) 
SPC-A-1(肺腺癌細胞) 
HGC-27(胃癌細胞（未分化）) 
LTEP-a-2(肺腺癌細胞) 
AGS(胃腺癌細胞) 
MGC80-3(胃癌細胞) 
95-D(高轉移肺癌細胞) 
BGC-823(胃腺癌細胞（低分化）) 
BT549(乳腺管癌細胞) 
SGC-7901(胃腺癌細胞) 
T-47D(乳腺管癌細胞) 
T-47D(乳腺管癌細胞) 
TE-11(食管癌細胞) 
SK-BR-3(乳腺腺癌細胞) 
SK-BR-3(乳腺腺癌細胞) 
TE-10(食管癌細胞) 
ZR-75-30(乳腺癌細胞) 
TE-1(食管癌細胞) 
Bcap-37(乳腺癌細胞) 
Eca-109(食管癌細胞) 
MDA-MB-453(乳腺癌細胞) 
CNE(鼻咽癌細胞) 
JAR(胎盤絨毛癌細胞) 
HEp-2(喉表皮樣癌細胞) 
NIH:OVCAR-3(卵巢癌細胞) 
KB(口腔表皮樣癌細胞) 
SK-OV-3(卵巢癌細胞) 
Acc-3(涎腺腺樣囊性癌細胞) 
HO-8910PM(高轉移卵巢癌細胞) 
Acc-2(涎腺腺樣囊性癌細胞) 
HO-8910(卵巢癌細胞) 
Tca-8113(舌鱗癌細胞) 
HCC 94 [HCC941122](子宮鱗癌細胞（高分化）) 
A-431(表皮癌細胞) 
HeLa 229(宮頸癌細胞) 
CBRH-7919(肝癌細胞) 
RH-35(肝癌細胞) 
SHZ-88(乳腺癌細胞) 
MLTC-1(睪丸間質細胞瘤細胞) 
L6565(小鼠L6565白血病克隆細胞系) 
F9(畸胎瘤細胞) 
LLC Lewis(肺癌細胞) 
C127(乳腺腫瘤細胞) 
MFC(胃癌細胞) 
B16(黑色素瘤細胞) 
B16(黑色素瘤細胞) 
P815(肥大細胞瘤細胞) 
S-180(腹水瘤細胞) 
RM-1(前列腺癌細胞) 
SAC-IIC3(腹水瘤細胞) 
NG108-15 [ 108CC15 ](小鼠神經(jīng)細胞瘤與大鼠神經(jīng)膠質瘤之融合細胞) 
SAC-IIB2(腹水瘤細胞) 
Hepa 1-6(肝癌細胞) 
P388D1(淋巴瘤細胞) 
P3X63Ag8.653(骨髓瘤細胞) 
YAC-1(淋巴瘤細胞) 
P3X63Ag8(骨髓瘤細胞) 
EL4. IL-2(淋巴瘤細胞) 
SP2/0(骨髓瘤細胞) 
EL4(淋巴瘤細胞) 
P3/NSI/1-Ag4-1 [NS-1](骨髓瘤細胞) 
PIEC(豬髖動脈內皮細胞) 
CRFK(貓腎細胞) 
EBTr (NBL-4)(牛胚氣管細胞) 
F81(貓腎細胞) 
Mv.1.Lu(NBL-7)(貂肺上皮細胞) 
MDCK (NBL-2)(狗腎細胞) 
RF/6A(猴脈絡膜-視網(wǎng)膜(內皮)細胞 ) 
MDBK (NBL-1)(牛腎細胞) 
LLC-MK2(恒河猴腎細胞) 
B95-8(EBV 轉化的絨猴白細胞) 
Vero(非洲綠猴腎細胞) 
COS-7(SV40 轉化的非洲綠猴腎細胞) 
CV-1(非洲綠猴腎細胞) 
COS-1(SV40 轉化的非洲綠猴腎細胞 ) 
293 [HEK-293] (人胚腎細胞) 
HBL-100(整合SV40 基因的乳腺上皮細胞) 
CGM1(EB 病毒轉化的B 細胞) 
WISH(羊膜細胞) 
HL-7702(肝細胞) 
Ha Fe(羊膜細胞) 
QSG-7701(肝細胞) 
HFL-I(MEMα)(胚肺成纖維細胞) 
HeLa [ Chang Liver ](張氏肝細胞) 
V79-4(中國倉鼠肺細胞) 
CHL/IU [ CHL-11 ](中國倉鼠肺細胞) 
CHO(中國倉鼠卵巢細胞) 
BHK(幼倉鼠腎細胞) 
R 1610(中國倉鼠體細胞) 
BRL 3A(大鼠肝細胞) 
NRK(大鼠腎細胞) 
L929(成纖維細胞) 
Y1(腎上腺皮質細胞) 
CTLL-2(T細胞) 
BALB/3T3(BALB/C小鼠胚成纖維細胞) 
Ana-1(巨噬細胞) 
SRSV/3T3(SRSV轉化的3T3細胞) 
3T6-Swiss albino(胚胎成纖維細胞) 
PA317(成纖維細胞) 
3T3-Swiss albino(胚胎成纖維細胞) 
Mo-MuLv/3T3(Mo-MuLv感染的3T3細胞) 
MRC-5(胚肺細胞) 
WI-38(胚肺細胞) 
FRhK-4(恒河猴胚腎細胞) 
VERO C1008 (E6)(非洲綠猴腎細胞) 
Pt K1 (NBL-3)(長鼻袋鼠腎細胞) 
L1210(白血病細胞) 
Neuro-2A(腦神經(jīng)瘤細胞) 
PC-12(腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞) 
HeLa(宮頸癌細胞) 
A549 [A-549](肺癌細胞) 
MCF7(乳腺癌細胞) 
Hep 3B2.1-7(肝癌細胞) 
MDA-MB-231(乳腺癌細胞) 
Hep G2(肝癌細胞) 
HCT 116(結腸癌細胞) 
22RV1(前列腺癌細胞) 
HT-29(結腸癌細胞) 
KG-1(白血病細胞) 
LoVo(結腸癌細胞) 
THP-1(單核細胞白血病) 
SW620(結腸癌細胞) 
SK-N-SH(神經(jīng)母細胞瘤細胞) 
SH-SY5Y(神經(jīng)母細胞瘤細胞) 
COLO 205(結腸癌細胞) 
T/G HA-VSMC(人主動脈血管平滑肌細胞） 
HUVEC（人臍靜脈血管內皮細胞） 
A10(大鼠主動脈血管平滑肌細胞) 
3T3-L1(小鼠脂肪細胞) 
A9(皮下結締組織細胞) 
WEHI 22.1(B淋巴細胞 ) 
NIH/3T3(胚胎成纖維細胞) 
MC3T3-E1 Subclone 14(小鼠原成骨細胞) 
L6(大鼠成肌細胞 ) 
H9c2(2-1)(大鼠心肌細胞) 
RSC96(大鼠雪旺細胞) 
CHO/dhFr-(中國倉鼠二氫葉酸還原酶缺陷細胞) 
Lec1(卵巢細胞) 
293T/17 [HEK 293T/17] (人胚腎細胞) 
AAV-293( 胚腎細胞 ) 
hFOB 1.19(SV40 轉染成骨細胞) 
CCD-1095Sk(皮膚細胞 ) 
Hs 578Bst(乳腺細胞) 
NK-92(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞) 
NK-92MI(人惡性非霍奇金淋巴瘤患者的自然殺傷細胞) 
HMy2.CIR(人B 淋巴母細胞) 
OK(負鼠(opossum)腎細胞) 
FO(骨髓瘤細胞) 
RAW 264.7(單核巨噬細胞白血病) 
P19(畸胎癌細胞) 
C6(膠質瘤細胞) 
RBL-2H3(白血病細胞) 
SiHa(子宮頸癌細胞) 
MG-63(骨肉瘤細胞) 
HEC-1-B(子宮內膜腺癌細胞) 
SW1353(骨肉瘤細胞) 
ES-2(卵巢透明細胞癌細胞) 
Saos-2(成骨肉瘤細胞) 
MDA-MB-468(乳腺癌細胞) 
SK-MES-1(肺鱗癌細胞) 
MDA-MB-435S(乳腺癌細胞) 
NCI-H661(大細胞肺癌細胞) 
ZR-75-1(乳腺癌細胞) 
NCI-H292(肺癌細胞（淋巴結轉移）) 
Hs 578T(乳腺癌細胞) 
U-937(組織細胞淋巴瘤細胞) 
CFPAC-1(胰腺癌細胞) 
A3(淋巴細胞白血病細胞) 
PANC-1(胰腺癌細胞) 
Jurkat,Clone E6-1(T 淋巴細胞白血病細胞) 
SK-HEP-1(肝癌細胞) 
HL-60(急性粒細胞白血病細胞) 
HCCLM3(肝癌細胞) 
TT(人甲狀腺癌細胞) 
PLC/PRF/5(肝癌亞力山大細胞) 
SW579(人甲狀腺癌細胞) 
RKO(結腸腺癌細胞) 
FaDu(人咽鱗癌細胞) 
NCI-N87(人胃癌細胞) 
DT40(雞淋巴瘤細胞)