一、生物毒性測(cè)試儀DXY-3目標(biāo)與要求

二、生物毒性測(cè)試儀DXY-3通過(guò)實(shí)驗(yàn)要求了解發(fā)光菌的生物毒性測(cè)試方法的基本原理。并搞清DXY型生物毒性測(cè)試儀的基本結(jié)構(gòu)、原理，并能進(jìn)行正確的操作和使用。

二、生物毒性測(cè)試儀DXY-3原理

發(fā)光菌的生物毒性測(cè)試是20世紀(jì)70年代后期建立起來(lái)的生物測(cè)試方法。發(fā)光菌是一種海洋發(fā)光細(xì)菌，屬一類(lèi)非致病的革蘭氏陰性兼性厭氧細(xì)菌，它們?cè)谶m當(dāng)?shù)臈l件下經(jīng)培養(yǎng)后，能發(fā)出肉眼可見(jiàn)的藍(lán)綠色的光。其發(fā)光原理是由于活體細(xì)胞內(nèi)具有ATP、螢光素（FMN）和螢光酶等發(fā)光要素。這種發(fā)光過(guò)程是細(xì)菌體內(nèi)的一種新陳代謝過(guò)程，即氧化呼吸鏈上的光呼吸過(guò)程。當(dāng)細(xì)菌合成螢光酶、螢光素、長(zhǎng)鏈脂肪醛時(shí)，在氧的參與下，能發(fā)生生化反應(yīng)，便產(chǎn)生光。光的峰值在490 nm左右。生化反應(yīng)如下：

當(dāng)發(fā)光菌接觸到環(huán)境中有毒污染物質(zhì)時(shí)，可影響或干擾細(xì)菌的新陳代謝，從而使細(xì)菌的發(fā)光強(qiáng)度下降或熄滅。有毒物質(zhì)的種類(lèi)越多、濃度越高，抑制發(fā)光的能力越強(qiáng)。這種發(fā)光強(qiáng)度的變化可用測(cè)光儀定量地測(cè)定出來(lái)。由于毒物濃度與菌體發(fā)光度呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān)，因而可根據(jù)發(fā)光度確定毒物急性生物毒性。由于發(fā)光菌的生物毒性測(cè)試方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏，所以在有毒物質(zhì)的篩選，環(huán)境污染生物學(xué)評(píng)價(jià)等方面有很大的實(shí)用價(jià)值。

三、生物毒性測(cè)試儀DXY-3實(shí)驗(yàn)條件

1．器材

DXY型生物毒性測(cè)試儀：配制2 mL、5 mL樣品測(cè)試管（具標(biāo)準(zhǔn)磨口塞）、微量注射器（1 uL）、注射器（l mL）、定量加液瓶（5 mL）、吸管（2 mL、10 mL、25 mL）、試劑瓶（10 mL）、量筒（100 mL、500 mL）。棕色容量瓶（50 mL、250 mL、1000 mL）、10 mL半微量滴定管（配磨口試劑瓶，全套儀器均為棕色）。恒溫震蕩器，隔水式培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，比色管架。

2．試劑和材料

（1）3％NaCl溶液

稱(chēng)取3 g NaCl于玻璃容器內(nèi)，用量筒加100 mL蒸餾水。

（2）2％NaCl溶液

稱(chēng)取2 g NaCl于玻璃容器內(nèi)，用量筒加 100 mL蒸餾水，2～5℃冰箱內(nèi)保存。

（3）參比毒物HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液

0.02，0.04，0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20，0.22，0.24（mg/L）

（4）HgCl2母液，ρ＝2000 mg/L

用電子天平稱(chēng)密封保存良好的無(wú)結(jié)晶水HgCl2 0.100 g于50 mL容量瓶，用3％ NaCl溶液稀釋至刻度，置 2～5℃冰箱備用，保存期6個(gè)月。

（5）HgCl2工作液，ρ＝2 mg/L

用移液管吸 HgCl2母液10 mL于1000 mL容量瓶，用3%NaCl溶液定容。再用移液管吸HgCl2 20 mg/L液25 mL入250 mL容量瓶，用3％NaCl溶液定容，將此液倒入配有半微量滴定管的試劑瓶，然后，用3％NaCl溶液將 HgCl2 2 mg/L溶液按下表稀釋成系列濃度（一律采用50 mL容量瓶）。這些 HgCl2稀釋液保存期不超過(guò)24 h，超過(guò)者務(wù)必重配。

實(shí)驗(yàn)表13－1  HgCl2工作液稀釋配置系列（在50 mL容量瓶中）

（6）明亮發(fā)光桿菌T3小種（Photobacterium phosphoreum T3 spp.）凍干粉

安瓿瓶包裝，每瓶0.5 g，在2～5℃冰箱內(nèi)有效保存期為6個(gè)月。

四、實(shí)驗(yàn)步驟與方法

1．儀器的預(yù)熱和調(diào)零

打開(kāi)生物發(fā)光光度計(jì)電源，預(yù)熱15 min，調(diào)零，備用。

2．試管的排列

在塑料或鐵制試管架上按以下二種情況排列測(cè)試管：

（1）當(dāng)樣品母液相對(duì)發(fā)光度為1％以上者，欲以與相對(duì)發(fā)光度相當(dāng)?shù)臐舛缺磉_(dá)結(jié)果者，如下排列：

左側(cè)放參比毒物HgCl2。系列濃度溶液管，右側(cè)放樣品管。前排放HgCl2溶液和樣品管，后一排放對(duì)照（CK）管，后二排放CK預(yù)試驗(yàn)管。每管HgCl2樣品液均配一管CK（3％NaCl溶液），設(shè)3次重復(fù)。每測(cè)一批樣品，常需同時(shí)配置測(cè)定系列濃度HgCl2標(biāo)準(zhǔn)溶液。

實(shí)驗(yàn)表13－2  測(cè)試管在試管架上的排列