目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>糖異生系列>> BC3310-50T/48S磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶測試盒 糖異生
| CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T/48S |
| 貨號 | BC3310 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
| 主要用途 | 丙酮酸羧激酶（PEPCK）檢測 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）活性檢測試劑盒說明書
紫外分光光度法
貨號：BC3310
規格：50T/48S
產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體60 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體45 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
試劑三 | 液體45 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體155 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑五 | 粉劑×1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、 試劑二：臨用前加入35 mL試劑一溶解。可溶解后分裝-20℃保存，避免反復凍融。
2、 試劑三：液體置于試劑瓶內EP管內。臨用前加入蒸餾水按體積比1：120稀釋，現用現配。
3、 試劑四：液體置于試劑瓶內EP管內。臨用前加入蒸餾水按體積比7：250稀釋，現用現配。
4、 試劑五：粉劑置于試劑瓶內玻璃管內。臨用前加入2.5 mL蒸餾水充分溶解；可溶解后分裝-20℃保存，避免反復凍融。
5、 工作液的配制：將試劑二、試劑三、試劑四按7:1:1（V:V:V）的比例配制工作液，工作液現用現配。
產品說明：
PEPCK（EC 4.1.1.32）廣泛存在于動物、開花植物、藻類、部分真菌和細菌中。該酶催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸，是調節糖異生途徑的第一限速酶。
PEPCK催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶進一步依次催化NADH氧化生成NAD+，在340nm下測定NADH下降速率，即可反映PEPCK活性。
注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品：
紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、1mL石英比色皿、可調式移液槍、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。
操作步驟：
一、樣本處理（可適當調整待測樣本量，具體比例可以參考文獻）
組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進行冰浴勻漿，然后8000g，4℃，離心10min，取上清，置冰上待測。
細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（104個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20%或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
血清（漿）樣本：直接檢測。
二、測定步驟
1、 紫外分光光度計預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零。
2、 將工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘。
3、 操作表：在1mL石英比色皿中依次加入下列試劑：
試劑名稱 | 空白管 | 測定管 |
樣本（µL） | 50 | |
蒸餾水（µL） | 50 | |
工作液（µL） | 900 | 900 |
試劑五（µL） | 50 | 50 |
加入試劑五后立即混勻，于340nm處測定初始吸光值A1和1min時的吸光值A2，計算ΔA測定管= A1測定-A2測定，ΔA空白管=A1空白-A2空白，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管（空白管只需做1-2次）。 | ||
三、PEPCK酶活計算
1、 按蛋白濃度計算
酶活定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK酶活（U/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×Cpr）÷T= 3215.4×ΔA÷Cpr
2、 按樣本質量計算
酶活定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK酶活（U/g 質量）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（V樣×W÷V樣總）÷T=3215.4×ΔA÷W
3、 按細菌或細胞數量計算
酶活定義：每104個細菌或細胞每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK酶活（U/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷（500×V樣÷V樣總）÷T= 6.43×ΔA
4、 按血清（漿）體積計算
酶活定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol 的NADH定義為一個酶活力單位。
PEPCK（U/mL）＝ΔA÷（ε×d）×109×V反總÷V樣÷T=3215.4×ΔA
ε：NADH摩爾消光系數，6.22×103 L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V反總：反應體系總體積，0.001L；V樣：反應體系中樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL，蛋白濃度自行測定；W：樣本質量，g，T：反應時間：1min；500：細菌或細胞總數，500萬；109：單位換算系數，1mol=109nmol。
注意事項：
1、 當A1小于1或ΔA大于0.6時，建議將樣本稀釋適當倍數后再進行測定，以提高檢測靈敏度。
2、 酶活性高的樣本如動物肝、腎等組織，建議將樣本用提取液稀釋5倍或5倍以上測定。
3、 空白管為檢測各試劑組分質量的檢測孔，正常情況下，變化不超過0.06。
4、 加樣、混勻等步驟要迅速，秒表計時要準確，如果條件允許建議由兩人配合完成本測定試驗。
實驗實例：
1、 取0.1g腎臟加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后再用提取液稀釋10倍，之后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.175-0.532=0.643，ΔA空白管=A1空白-A2空白=1.29-1.244=0.046，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.643-0.046=0.597，按樣本質量計算酶活得：
PEPCK酶活（U/g質量）= 3215.4×△A÷W×10（稀釋倍數）=3215.4×0.597÷0.1×10=191959.4 U/g 質量。
2、 取0.1g蘆薈加入1mL提取液進行勻漿研磨，取上清后按照測定步驟操作，測得計算ΔA測定管= A1測定-A2測定=1.257-1.106=0.151，ΔA空白管= A1空白-A2空白=1.29-1.244=0.046，ΔA=ΔA測定管-ΔA空白管=0.151-0.046=0.105，按樣本質量計算酶活得：
PEPCK酶活（U/g質量）= 3215.4×ΔA÷W=3215.4×0.105÷0.1=3376.17 U/g 質量。
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