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二氫黃酮醇還原酶（DFR）活性檢測試劑盒說明書

紫外分光光度法

貨號：BC5780

規格：50T/48S

產品組成：使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致，有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。

溶液的配制：

1、 提取液：臨用前用蒸餾水稀釋10倍后使用，稀釋后的提取液可2-8℃保存8周。

2、 混合液：臨用前將試劑一，試劑二和試劑三共同溶于1mL無水乙醇中充分溶解，溶解后的試劑2-8℃可以保存4周。

3、 工作液：臨用前根據樣本量按照混合液：蒸餾水=10μL:990μL（1000μL，10T）的比例配制，現用現配。

4、 試劑五：試劑放于瓶內玻璃管內。臨用前加入6.25mL蒸餾水中充分溶解，溶解后的試劑-20℃分裝保存可以保存4周，避免反復凍融。

產品說明：

二氫黃酮醇還原酶，即二氫黃酮醇-4-還原酶（Dihydroflavonol-4-reductase, DFR）是植物花青素生物合成途徑的關鍵酶，可催化二氫黃酮醇生成不同的花青素前體，因此DFR決定著植物中花青素的種類和含量，從而影響植物組織或器官的顏色。

DFR、NADPH和二氫黃酮醇反應生成花青素前體。NADPH在340nm處有最大吸收峰。通過檢測NADPH在340nm下的變化速率，即可得到DFR活性的大小。

注意：實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL石英比色皿、研缽/勻漿器、無水乙醇（AR）、硫酸銨（AR）、冰和蒸餾水。

操作步驟：具體的操作步驟請見“產品資料"文件

注意事項：

1、 如果?A測定＞1或者A1測定＜A1空白，可以用提取液（稀釋）將樣本（前處理中的沉淀溶解液）進行稀釋或者縮短30℃反應時間；?A測定小于0.01，可以加大樣本量或者延長30℃反應時間。最終計算時同步修改計算公式。

實驗實例：

1、 稱取0.2249g芒果，加入提取液進行冰浴勻漿，按照測定步驟操作，用1mL石英比色皿測得計算?A測定=1.163- 1.045=0.118，?A空白=1.099-1.015=0.084，?A =?A測定-?A空白=0.034，帶入公式計算：

DFR活性(U/g 質量)=23.58×ΔA÷W =3.565 U/g 質量

參考文獻：

[1] Hayashi M, Takahashi H, Tamura K, et al. Enhanced dihydroflavonol-4-reductase activity and NAD homeostasis leading to cell death tolerance in transgenic rice[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2005, 102(19):p.7020-7025.

[2] Petit P, Granier T, Béatrice Langlois d'Estaintot, et al. Crystal Structure of Grape Dihydroflavonol 4-Reductase, a Key Enzyme in Flavonoid Biosynthesis[J]. Journal of Molecular Biology, 2007, 368(5):1345-1357.

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