目錄:北京索萊寶科技有限公司>>生化檢測試劑盒-常量法>>抗逆系列>> BC5160-50T/24S超氧化物歧化酶活性檢測試劑盒 抗逆
CAS | 詳詢 | 純度 | 詳詢 |
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分子量 | 詳詢 | 分子式 | 詳詢 |
供貨周期 | 現貨 | 規格 | 50T/24S |
貨號 | BC5160 | 應用領域 | 環保,化工,生物產業,農業,綜合 |
主要用途 | 超氧化物歧化酶活性檢測 |
超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒(WST-1法)說明書
可見分光光度法
注意:本產品試劑有所變動,請注意并嚴格按照該說明書操作。
貨號:BC5160
規格:50T/24S
產品組成:使用前請認真核對試劑體積與瓶內體積是否一致,有疑問請及時聯系索萊寶工作人員。
試劑名稱 | 規格 | 保存條件 |
提取液 | 液體30mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑一 | 液體15 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑二 | 液體40 μL×1支 | 2-8℃保存 |
試劑三 | 液體11 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
試劑四 | 液體0.3mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制:
1、 試劑二:使用前先使用掌上離心機離心至管底再吹打混勻;
2、 試劑二工作液:根據樣本數量按試劑二:蒸餾水=5μL:395μL(共400μL,約4S)的比例配制試劑二工作液,現用現配;
3、 試劑四工作液:根據樣本量按試劑四:蒸餾水=20μL:180μL(共200μL,約4T)的比例配制試劑四工作液,現用現配。
產品說明:
SOD(EC 1.15.1.1)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞中,催化超氧化物陰離子發生歧化作用,生成H2O2和O2。SOD不僅是超氧化物陰離子清除酶,也是H2O2主要生成酶,在生物抗氧化系統中具有重要作用。
通過黃*呤及黃*呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子(O2-),O2-可與WST-1反應生成水溶性黃色甲臜,后者在450nm處有吸收峰;SOD可清除O2-,從而抑制了甲臜的形成;反應液黃色越深,說明SOD活性愈低,反之活性越高。
注意:實驗之前建議選擇2-3個預期差異大的樣本做預實驗。如果樣本吸光值不在測量范圍內建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋/恒溫培養箱、電子天平、可調式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽/勻漿器/細胞超聲破碎儀、冰和蒸餾水。
操作步驟:
一、樣本處理(可適當調整待測樣本量,具體比例可以參考文獻)
1. 細菌或培養細胞樣本:收集細菌或細胞到離心管內,離心后棄上清,按照細菌或細胞數量(104個):提取液體積(mL)=500-1000:1的比例(建議500萬細菌或細胞加入1mL提取液),超聲波破碎細菌或細胞(冰浴,功率200W,超聲3s,間隔10s,重復30次),8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 組織樣本:按照組織質量(g):提取液體積(mL)為1:5-10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液),進行冰浴勻漿;8000g 4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
3. 血清(漿)樣本:直接檢測。若有渾濁可離心后取上清進行測定。
二、測定步驟
1. 分光光度計預熱30min以上,調節波長至450nm,蒸餾水調零。
2. 測定前將試劑一、試劑三和試劑四工作液37℃水浴5min以上。
3. 樣本測定(在EP管中按順序加入下列試劑)
試劑名稱(μL) | 測定管 | 對照管 | 空白管1 | 空白管2 |
樣 本 | 90 | 90 | - | - |
試劑一 | 225 | 225 | 225 | 225 |
試劑二工作液 | 100 | - | 100 | - |
試劑三 | 175 | 175 | 175 | 175 |
蒸餾水 | 360 | 460 | 450 | 550 |
試劑四工作液 | 50 | 50 | 50 | 50 |
充分混勻,37℃水浴30min后,置于1mL玻璃比色皿測定450nm下的吸光度,分別記為A測定、A對照、A1空白、A2空白,計算ΔA測定=A測定-A對照,ΔA空白=A1空白-A2空白。(空白管1和空白管2各只需做1~2管,每個樣本有一個對照管)
三、 SOD活性計算
1、抑制百分率的計算:
抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白× 100%
盡量使樣本的抑制百分率在30-70%范圍內,越靠近50%越準確。如果計算出來的抑制百分率小于30%或大于70%,則通常需要調整加樣量后重新測定。如果測定出來的抑制百分率偏高,則需適當稀釋樣本;如果測定出來的抑制百分率偏低,則需重新準備濃度比較高的待測樣本或者提高加樣表中的樣本量,但需相應減少測定管和對照管中蒸餾水的體積。
2、SOD酶活性單位:在上述黃*呤氧化酶偶聯反應體系中抑制百分率為50%時,反應體系中的SOD酶活力定義為一個酶活力單位。
3、SOD酶活性計算:
(1)血清(漿)SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率)×F
(2)組織、細菌或培養細胞SOD活力計算:
A. 按樣本蛋白濃度計算
SOD活性 (U/mg prot)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(V樣×Cpr)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷Cpr×F
B. 按樣本質量計算
SOD活性 (U/g 質量)=[抑制百分率÷(1 -抑制百分率)×V反總]÷(W×V樣÷V樣總)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F
C. 按細菌或細胞數量計算
SOD活力 (U/104 cell)= [抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷(N×V樣÷V樣總)×F
=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F
V反總:反應體系總體積,1mL;V樣:加入反應體系中樣本的體積,0.09mL;V樣總:加入提取液體積,1mL;Cpr:樣本蛋白質濃度,mg/mL;W:樣本質量,g;N:細胞或細菌總數,以104計;F:樣本稀釋倍數。
注意事項:
1、 樣本和試劑二工作液使用時在冰上放置。
2、 樣本較多時,可按表格配制測定管工作液和對照管工作液(包含試劑一、(試劑二工作液)、試劑三、蒸餾水),試劑四工作液必須最后加入。
實驗實例:
1、 取0.1016g大鼠肝臟加入1mL提取液進行勻漿研磨,取上清稀釋50倍,按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.502-0.011=0.491,ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978,抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=49.796%,按樣本質量計算酶活得:
SOD活性(U/g 質量)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =5423.086 U/g 質量。
2、 取0.1024g綠蘿葉片加入1mL提取液進行勻漿研磨,取上清稀釋3倍,按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.490-0.105=0.385,ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978,抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=60.634%,按樣本質量計算酶活得:
SOD活性(U/g 質量)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷W×F =501.338 U/g 質量。
3、 450×104個Hela細胞,加入1mL提取液進行勻漿研磨,取上清按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.523-0.027=0.496,ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978,抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=49.284%,按細胞數量計算酶活得:
SOD活性(U/104 cell)=11.11×抑制百分率÷(1-抑制百分率) ÷N×F =0.024 U/104 cell。
4、 取225μL兔血清(相應減少蒸餾水用量)按照測定步驟操作,用1mL玻璃比色皿測得計算ΔA測定= A測定-A對照=0.855-0.158=0.697,ΔA空白=A1空白-A2空白=0.983-0.005=0.978,抑制百分率=(ΔA空白-ΔA測定) ÷ΔA空白×100%=28.732%,按血清(漿)體積計算酶活得:
血清(漿)SOD活性(U/mL)=[抑制百分率÷(1-抑制百分率)×V反總]÷V樣×F=1.792 U/mL。
參考文獻:
[1] Peskin A V, Winterbourn C C. A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1) [J]. Clinica chimica acta, 2000, 293(1-2):157-166.
[2] Hou Z, Zhao L, Wang Y, et al. Purification and characterization of superoxide dismutases from sea buckthorn and chestnut rose[J]. Journal of food science, 2019, 84(4): 746-753.
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