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MKN1細(xì)胞,人胃癌細(xì)胞株 (細(xì)胞培養(yǎng)中常見的生物污染類型有7種,分別是細(xì)菌污染、支原體污染、原蟲污染、黑膠蟲污染、真菌污染、病毒污染以及非細(xì)胞污染,那么他們污染細(xì)胞的特點(diǎn)分別是什么呢?怎樣能夠減少污染現(xiàn)象的發(fā)生?)
1-細(xì)菌
細(xì)菌污染常見的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細(xì)菌污染較易發(fā)現(xiàn),在普通倒置顯微鏡下為黑色細(xì)沙狀,培養(yǎng)液一般會在短時(shí)間內(nèi)變黃,有時(shí)靜置的培養(yǎng)液不混,稍加震蕩會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時(shí)在細(xì)胞表面及周圍有大量細(xì)菌存在,細(xì)胞停止生長并有中毒表現(xiàn)。
處理:①在培養(yǎng)液中加入相應(yīng)的抗生素,能夠預(yù)防絕大多數(shù)的細(xì)菌污染。
2-真菌
真菌污染是細(xì)胞培養(yǎng)過程中zui常見的一種,尤其梅雨季節(jié)快要到了,進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)更易污染。污染細(xì)胞的多為煙曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多數(shù)在培養(yǎng)液中形成白色或淺黃色漂浮物。一般肉眼可見,較易被發(fā)現(xiàn),短期內(nèi)培養(yǎng)液多不混濁,倒置顯微鏡下可見于細(xì)胞之間縱橫交錯(cuò)穿行的絲狀、管狀、及樹枝狀菌絲,并懸浮飄蕩在培養(yǎng)液中。
很多菌絲在高倍鏡可見到有鏈狀排列的菌珠;念珠菌或酵母菌形態(tài)呈卵形,散在細(xì)胞周邊和細(xì)胞之間生長。鏡下看時(shí),要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈,以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。
真菌污染后,細(xì)胞生長變慢,但zui后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細(xì)胞脫落死亡。真菌生長的比較慢,不象細(xì)菌那么容易被發(fā)現(xiàn),但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細(xì)胞就被污染了,也很難救活了。
3-支原體
支原體的大小介于細(xì)菌和病毒之間,是一種獨(dú)立生活的微生物。對熱敏感,對一般抗生素不敏感。支原體的形態(tài)多變,多吸附在細(xì)胞表面和細(xì)胞之間。電鏡下觀察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細(xì)胞微絨毛相似。
因國內(nèi)的血清大多數(shù)都沒有做支原體陰性檢測,而支原體又是牛血清中zui常見的微生物之一。支原體污染細(xì)胞后,培養(yǎng)液輕微發(fā)生混濁.但細(xì)胞變化不顯著,隨著細(xì)胞的培養(yǎng)會慢慢死亡。
支原體污染檢測(熒光染色法):DNA和與DNA特異性結(jié)合的熒光染料結(jié)合,使得支原體的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細(xì)胞同圍或附于細(xì)胞膜表面的亮綠色小點(diǎn)。
解決:
1)抗生素排除法:支原體污染預(yù)防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規(guī)使用的5倍濃度)作用24-48小時(shí),再換入常規(guī)培養(yǎng)液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素 200μg/ml ,四環(huán)素10μg/ml ,卡那霉素50μg/ml 。
2)加溫除菌:支原體不耐熱,可以對支原體污染的細(xì)胞熱處理除菌。因高溫對細(xì)胞本身也會產(chǎn)生一定影響,故熱處理前需先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn),確定對細(xì)胞影響zui小而能zui大程度的殺死支原體的時(shí)間。
4-黑膠蟲
黑膠蟲的存在目前尚有爭議,其在低倍下為黑色點(diǎn)狀,高倍下可看見黑色的小蟲游來游去,培養(yǎng)液也是不渾的,對細(xì)胞生長狀態(tài)不會有明顯影響,在細(xì)胞增殖旺盛之后會自然消失,除更換血清外無須特殊處理。
5-原蟲
培養(yǎng)液可輕微渾濁,顯微鏡下那些細(xì)小的點(diǎn)狀物數(shù)量非常多,輕微活動,細(xì)胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢,而且細(xì)胞狀態(tài)不好,邊緣不清楚,細(xì)胞不透亮。他們與細(xì)胞可共生但會與細(xì)胞爭奪營養(yǎng)。這種共生是非常普遍的,但他們的數(shù)量小,細(xì)胞站優(yōu)勢所以不會影響到細(xì)胞的正常生長,只有當(dāng)他們到達(dá)一定的數(shù)量時(shí)就會影響到細(xì)胞的生長,zui終形成惡性循環(huán)。
6-病毒
組織細(xì)胞培養(yǎng)過程中,如果沒有除去潛在的病毒,就會產(chǎn)生病毒污染。目前,從原代猴腎細(xì)胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。 盡管病毒污染的細(xì)胞不影響原代培養(yǎng),但生產(chǎn)疫苗是不安全的。因此,潛在病毒是細(xì)胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。
7-非同種細(xì)胞污染
即細(xì)胞交叉污染,由于細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí)各細(xì)胞株所需的器材和溶液沒有嚴(yán)格分開,往往會使一種細(xì)胞被另一種細(xì)胞污染。目前,世界上已有幾十種細(xì)胞都被HeLa細(xì)胞所污染,致使許多實(shí)驗(yàn)宣告無效。非細(xì)胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生,大多是由于細(xì)胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不*而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。
污染是細(xì)胞培養(yǎng)的大敵,預(yù)防和避免污染是成功培養(yǎng)細(xì)胞的關(guān)鍵之一。危機(jī)意識要貫徹實(shí)驗(yàn)的始終,否則不僅浪費(fèi)時(shí)間,而且浪費(fèi)人力、物力,甚至造成無法彌補(bǔ)的損失。
MKN1細(xì)胞,人胃癌細(xì)胞株(如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)的污染和清除這些污染物呢?)慧穎 細(xì)胞庫 技術(shù)為您解答:
一、污染的預(yù)防
預(yù)防是防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染的辦法。只有預(yù)防工作做在前,才能將發(fā)生污染的可能性降到zui小程度。一般預(yù)防可從以下幾方面著手:
1-從操作者做起
1操作者責(zé)任心要強(qiáng),要細(xì)心穩(wěn)重,操作技術(shù)要熟練。進(jìn)無菌室前要用肥皂洗手或用5%新潔爾滅浸泡5分鐘,按規(guī)定穿隔離衣。進(jìn)入后關(guān)好門,坐下來盡量少走動。工作開始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和燒灼瓶口。事先要嚴(yán)格檢查器材、溶液和培養(yǎng)物,不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無菌室內(nèi),更不能隨便使用,以免造成大批污染。
2、操作者動作要輕,必須在火焰周圍無菌區(qū)內(nèi)打開瓶口,并將瓶口轉(zhuǎn)動燒灼。操作時(shí)盡量不要談話,若打噴嚏或咳嗽應(yīng)轉(zhuǎn)向背面。
3、操作時(shí)要常更換吸管,切勿一根吸管做到底。一旦發(fā)現(xiàn)吸管口接觸了手和其他污染物品應(yīng)棄去。實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾,保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊,zui后用消毒水浸泡的紗布擦臺面。
2-從物品、用品消毒滅菌著手
細(xì)胞培養(yǎng)所用物品清洗、消毒要*,各種溶液滅菌除菌要仔細(xì),并在無菌試驗(yàn)陰性后才能使用。操作室及剩余的無菌器材要定期清潔消毒滅菌。
3-防止細(xì)胞交叉污染
在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),所用器具要嚴(yán)格區(qū)分,做上標(biāo)記便于辨別。并按順序進(jìn)行操作,避免一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生混亂。
在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),注射器和滴管不要觸及細(xì)胞培養(yǎng)瓶瓶口,以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細(xì)胞。
所有細(xì)胞一旦購置,或從別處引入,或自己建立,均應(yīng)及早留種凍存,一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇,重新培養(yǎng)。
二、污染的清除
培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)污染,多數(shù)較難處理。如果污染細(xì)胞價(jià)值不大,宜棄之;有細(xì)胞株留存的或可購置的,可在尋找原因后*消毒操作室,復(fù)蘇或重新購置細(xì)胞,再培養(yǎng)。若污染細(xì)胞價(jià)值較大,又難于重新得到,可采取以下辦法清除。
1-使用抗生素
抗生素對殺滅細(xì)菌較有效。聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥效果好。預(yù)防用藥比污染后再用藥效果好。預(yù)防用藥一般用雙抗生素(青霉素100u/mL加鏈霉素100μg/mL),污染后清除用藥需采用大于常用量5~10倍的沖洗法,于加藥后作用24~48小時(shí),再換常規(guī)培養(yǎng)液。此法在污染早期可能有效。所用抗生素品種除青霉素、鏈霉素外,還可用慶大霉素、卡那霉素、多粘菌素、四環(huán)素、制霉菌素等。常用400~800μg/mL卡那霉素或200μg/mL四環(huán)素處理,每隔2~3日換液1次,傳1~2代進(jìn)行治療。近年來有報(bào)道,4-氟,2-羥基喹啉(Ciprofloxacin,Cip)、截耳素衍生物(Pleu-romutilinderivative,BM-Cyclin2:BM-1和四環(huán)素衍生物(BM-2)等三種抗生素單用或合用對殺滅支原體有效。這三種抗生素均用PBS配成250濃縮液,-20℃保存?zhèn)溆茫褂脻舛菴ip為10μg/mL,BM-1為10μg/mL,BM-2為5μg/mL。使用時(shí)先吸除污染的培養(yǎng)液,加入含BM-1的RPMI1640培養(yǎng)液,3天后再吸除培養(yǎng)液,加入含BM-2的RPMI1640培養(yǎng)液,培養(yǎng)4天,如此連續(xù)3個(gè)輪次,直至用33258熒光染色鏡檢證明已清除支原體后,再加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)傳代3-4次。
2-使用支原體特異性血清
用5%的兔支原體免疫血清(血凝效價(jià)1:320以上)可去除支原體污染,因特異抗體可抑制支原體生長,故經(jīng)抗血清處理后11天即轉(zhuǎn)為陰性,并且5個(gè)月后仍為陰性。但此法比較麻煩,不如用抗生素方便、經(jīng)濟(jì)。
3-加溫處理
將污染的組織培養(yǎng)物放在41℃培養(yǎng)18小時(shí),可殺死支原體,但對細(xì)胞有不良影響。所以在處理前要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn),摸索能zui大限度殺死支原體又對細(xì)胞影響zui小的加熱時(shí)間。此法有時(shí)不可靠。若先用藥物處理后,再以41℃加溫處理效果更佳。
4-其他方法
除了上述去除污染的方法外,還有動物體內(nèi)接種除菌法、巨噬細(xì)胞吞噬法、污染培養(yǎng)瓶中加溴尿嘧啶再用光照射的方法及過濾法等,但均較麻煩,且效果不確定。所以一旦支原體污染,除非有特別重要價(jià)值,一般均棄之重新培養(yǎng)。
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