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一、Western Blot實驗原理
蛋白免疫印跡（Western Blot，WB）是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的技術(shù)。完整的WB流程，如下圖所示，包含樣本制備、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合、蛋白檢測等5個大步驟。

二、試劑準(zhǔn)備
詳見文末附錄。

三、實驗步驟
1. 樣本制備
1）融解RIPA裂解液，混勻。取適當(dāng)量的裂解液，在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的zui終濃度為1mM。
2）貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液，用PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍。按照6孔板每孔加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸。細(xì)胞充分裂解后應(yīng)無沒有明顯的細(xì)胞沉淀。
懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞，用手指把細(xì)胞用力彈散。按照6孔板每孔細(xì)胞加入150-250 μL裂解液的比例加入裂解液。再用手指輕彈以充分裂解細(xì)胞。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成0.5-1×10⁶個細(xì)胞/管，然后再裂解。
組織樣本：按照每20 mg組織加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。用玻璃勻漿器勻漿，直至充分裂解。
3）充分裂解后，10000-14000g離心3-5min，取上清，即可進(jìn)行后續(xù)的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
【注】：RIPA裂解液的裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團(tuán)透明膠狀物，屬正常現(xiàn)象。該透明膠狀物為含有基因組DNA等復(fù)合物。在不檢測和基因組DNA結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗；如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗。如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子，例如NF-kappaB、p53等時，通常不必進(jìn)行超聲處理，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因子。   

2. 蛋白定量
1）配制BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為蛋白樣品的溶解液，原則上蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但也可用0.9%的NaCl或1×PBS進(jìn)行稀釋。BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制可參考下表。
表1 BSA標(biāo)準(zhǔn)品體系配制（微孔板檢測，線性范圍20-2000μg/mL）*

*如用比色皿檢測，每管需加100μL標(biāo)準(zhǔn)品，按3個重復(fù)計算，每個濃度至少需配制300μL。
2）各取25μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品加入到微孔板中。
3）每孔加入200μL BCA工作液，振蕩30s充分混勻。蓋上微孔板，37℃孵育30min。
4）冷卻到室溫，在酶標(biāo)儀上的540-595nm波長范圍處檢測吸光度，其中562nm波長為*。
5）根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（減去標(biāo)準(zhǔn)品中空白孔的OD值即zui終的讀數(shù)），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（X-蛋白濃度ug/mL；Y-zui終的OD562nm）。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣品的稀釋倍數(shù)計算樣品蛋白濃度。

3. 蛋白電泳
1）剪開包裝取出預(yù)制膠，將預(yù)制膠固定在電泳槽中，內(nèi)槽加滿tris-glycine電泳緩沖液，外槽液面低于內(nèi)槽5-10mm，雙手按住梳子左右部位將其平穩(wěn)緩慢（一定要慢，否則會將膠齒拔斷或拔歪）拔出。
2）在室溫或不超過37℃的水浴中溶解5×SDS-PAGE上樣緩沖液。水浴溶解后立即室溫存放。
3）按照每4 μL蛋白樣品加入1μl 5×SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液的比例，混合蛋白樣品和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。
4）100℃或沸水浴加熱 3-5min，以充分變性蛋白，之后冷卻至室溫備用。
5）在每個樣品孔中上樣20-40µg蛋白，并在1個孔中上樣蛋白marker，蓋上電泳槽蓋，打開電源，推薦使用低壓100V，跑15min，之后換高壓150V跑，通常電泳至藍(lán)色染料到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳。
6）電泳后取出膠板，用刀在側(cè)邊硅膠處，沿著兩片玻璃縫隙切開硅膠，即可打開玻璃板；取膠時，需在膠和玻璃條之間，沿著玻璃條劃一刀，防止發(fā)生粘連。掰開兩板，將膠取出，此時蛋白會從凝膠上慢慢擴散，因此不要保存在凝膠里，要迅速進(jìn)行下一步的轉(zhuǎn)移操作。
      
4. 轉(zhuǎn)膜與封閉
1）將膠浸于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡5min。（如果檢測小分子蛋白質(zhì)，可省略該步驟，因小分子蛋白容易擴散）。
2）依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中平衡10min，如用PVDF膜，需參照說明書，先用純甲醇浸泡1-2min，再孵育于預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液中。（膜的選擇：0.45μm孔徑，用于一般蛋白；0.2μm孔徑，用于分子量小于20kD蛋白；0.1μm孔徑，用于分子量小于7kD蛋白。）
3）裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿/3層濾紙/膠/膜/3層濾紙/海綿，每層放好后，用試管趕盡氣泡。
4）將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近陽極，膠靠近陰極，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。
5）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出膜。
6）將膜浸沒在5mL麗春紅染色液中，置于軌道搖床上室溫染色5~10min或更長，直待膜上顯示出蛋白條帶。注：如果沒有出現(xiàn)染色條帶，則表示轉(zhuǎn)膜失敗，可能需要重新轉(zhuǎn)膜或重新上樣電泳。
7）清洗：取出膜，用蒸餾水，PBS或者其他適當(dāng)溶液沖洗至背景清晰后拍照，大概沖洗2~3次，每次5min。
8）脫色：將膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脫液，再重復(fù)一次。
9）清洗：再用蒸餾水清洗膜2~3次，每次5min。
10）將膜置于25mL封閉緩沖液中，在室溫下孵育1小時。
11）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。

5. 抗體孵育與檢測
1）將膜和一抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL一抗稀釋緩沖液中在4°C下孵育過夜并不時輕輕晃動。
2）用5mL TBST洗滌三次，每次15min以去除殘留的一抗。
3）將膜和二抗（按照產(chǎn)品應(yīng)用推薦稀釋度）置于10mL封閉緩沖液中孵育1-2小時并不時輕輕晃動。
4）用5mL TBST洗滌三次，每次15min。
5）zui后一次洗膜的同時，按照ECL超敏試劑盒說明書，新鮮配制發(fā)光工作液。
6）用平頭鑷取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液，勿使膜*干燥。將膜*浸入發(fā)光工作液（125μL發(fā)光工作液/cm²膜）中，與發(fā)光工作液充分接觸。室溫孵育3min，準(zhǔn)備立即壓片曝光。
7）用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發(fā)光工作液。但勿洗去發(fā)光液。
8）在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來*包裹印跡膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi)，蛋白帶面向上。
9）暗房內(nèi)壓X光膠片，分別曝光不同的時間，如數(shù)秒到數(shù)分鐘。顯影沖洗。（從剛開始的10s曝光時間中可以看出適當(dāng)?shù)钠毓鈺r間。由于檢測反應(yīng)的動力學(xué)特征，在孵育后信號立即變得zui強，但在隨后的2小時內(nèi)會減弱。）

四、常見問題

 
附錄：Western Blot快速實驗試劑準(zhǔn)備
1. 各類緩沖液

2. 樣本制備

3. 蛋白定量

4. 蛋白電泳

5. 轉(zhuǎn)膜與封閉

6. 抗體孵育