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供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 生物產業 |
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HB180502
TRITC Phalloidin 羅丹明標記鬼筆環肽
產品信息
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背景描述
鬼筆環肽(Phalloidin)是一種來源于毒蕈類鬼筆鵝膏(Amanita phalloides)的環狀七肽毒素,以高親和力(Kd= 20 nM) 選擇性結合于絲狀肌動蛋白 F-actin,而不會與單體肌動蛋白 G-actin 結合,通常用來標記組織切片,細胞培養物或無細胞體 系中的 F-actin,從而對 F-actin 進行定性和定量分析。另外,鬼筆環肽衍生物也以相近的親和力結合于大小纖維,無論是動 植物來源的肌肉細胞或非肌肉細胞,按照每一個肌動蛋白亞基約與一個鬼筆環肽分子的計量比結合。且非特異性結合幾乎可 忽略,染色區域和非染色區域辨識度非常明顯。因此,鬼筆環肽衍生物特別適合替代肌動蛋白(Actin)抗體進行相關研究。 另外鬼筆環肽衍生物很小,直徑約 12-15?,分子量<2000 Daltons,未標記肌動蛋白(Actin)的許多生理特性都得以維持, 比如,同肌動蛋白結合蛋白如肌球蛋白,原肌球蛋白,DNase I 等仍能發生反應;鬼筆環肽標記的纖維絲仍可穿透固相肌球 蛋白基質;以及甘油抽提的肌纖維標記后仍可收縮等。
鬼筆環肽(Phalloidin)的結合阻止絲狀肌動蛋白(微絲)的解離,穩定微絲結構,從而破壞微絲的聚合-去聚合的動態 平衡。此特性使得肌動蛋白聚合發生的臨界濃度(CC)降至<1 µg/mL,因此,可用作一種聚合促進劑。此外,鬼筆環肽還 可抑制 F-actin 的 ATP 水解活性。
本品為 TRITC(四甲基異硫氰酸羅丹明)標記的鬼筆環肽,染色反應特異性強,對比性高,具有比 Actin 抗體更好的染 色效果,適合用作 F-actin 的定性和定量檢測。另外,經本品結合后的 F-actin 仍能維持 actin 自身具有的許多生物學特性。 且本品的結合沒有物種差異性,適用性廣泛。
我司分別提供凍干粉形式(貨號:40734ES80)和儲存液形式(貨號:40734ES75,濃度為 20 µM)的 TRITC 標記鬼筆 環肽,用戶根據自身需求選擇。建議使用濃度為 80~200 nM。
產品性質
分子式(Molecular Formula) | C60H70N12O13S2 |
分子量(Molecular Weight) | 1231.4 |
///大激發/發射波長(Ex/Em) | 540~546/565~575 nm |
多肽序列(Sequence) | TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-L eu)(S-3 to 6) |
外觀(Appearance) | 紫色粉末(凍干粉) |
溶解性(Solubility) | 溶于 DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液(20%) |
運輸與保存方法
冰袋運輸。-20℃避光干燥保存, 1年有效。
注意事項
1) 鬼筆環肽具有毒性,需小心操作(對人的半數致死劑量 LD50 約 2 mg/kg)。
2) 為了您的安全和健康,請穿實驗服并戴一次性手套操作。
需要自備材料
1) (可選)甲醇
2) 1×PBS 緩沖液, pH 7.4, 細胞培養級別(貨號:60145ES76)
3) 固定液 4%多聚甲醛(溶于 PBS 緩沖液)(貨號:36314ES60)
4) 丙酮或透化液 0.5% Triton X-100(溶于 PBS 緩沖液)
5) Fluoromount-GTM 水溶性封片劑(不含 DAPI)(貨號:36307ES08),DAPI(貨號:40727ES10)
6) (可選)DAPI Fluoromount-GTM 水溶性封片劑(含 DAPI)(貨號:36307ES08)
7) (可選)BSA,標準級別(貨號:36101ES25)
8) 載玻片和蓋玻片
9) 蓋玻片周圍密封液(如透明指甲油)
10)組裝有 TRITC 激發/發射濾片,以及 DAPI 激發/發射濾片的熒光顯微鏡或共聚焦顯微鏡。
操作步驟
1.工作液準備
1)對于 TRITC 標記鬼筆環肽(貨號:40734ES75,300T)
本品以溶于甲醇的 20 µM 儲存液形式提供,總量為 300 µL。按照 100 nM 的工作液濃度來換算,可制備總量為 60 mL 的工 作液。建議收到產品后,根據單次使用量,對母液進行小量分裝,-20℃避光凍存,一年穩定。
開始實驗前,使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為:80~200 nM。工作液現配現用。
2)對于 TRITC 標記鬼筆環肽(貨號:40734ES80,1mg)
本品以凍干粉形式提供,分子量為 1231.4,總量為 1 mg。可先用甲醇或者 DMSO 充分溶解配制成 20~100 µM 的儲存液。 如,加入 8.1208 mL 甲醇到 1 mg 鬼筆環肽即得到 100 µM 等量的儲存液,根據單次使用量,進行小量分裝,-20℃避光凍 存,一年穩定。
開始實驗前,使用 1×PBS 緩沖液稀釋儲存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為:80~200 nM。工作液現配現用。
2.染色步驟
1)細胞爬片生長 24 h,使其密度達到 50%匯合度。
2)吸掉培養液,37℃預熱的 1×PBS(pH 7.4)清洗細胞 2 次。
3)使用溶于 PBS 的 4%進行細胞固定,室溫固定 10 min。
【注】避免固定劑中含有甲醇成分,因為甲醇在固定過程中可能破壞肌動蛋白。
4)室溫條件下,用 PBS 清洗細胞 2~3 次,每次 10 min。
5)室溫條件下,用丙酮(≤-20℃)脫水或者用 0.5% Triton X-100 溶液透化處理 5 min。
6)室溫條件下,用 PBS 清洗細胞 2~3 次,每次 10 min。
7)取 200 µL 配制好的 TRITC 標記鬼筆環肽工作液,覆蓋住蓋玻片上的細胞,室溫避光孵育 30 min(通常情況下,4℃~37℃ 孵育皆可)。
【注】為了降低背景,可于 TRITC 標記的鬼筆環肽工作液內加入 1% BSA;另外,孵育過程中為了避免溶液揮發,可 將蓋玻片轉移到一個密封的容器內。
8)用 PBS 清洗蓋玻片 3 次,每次 5 min。
9)使用 200 µL DAPI 溶液(濃度:100 nM)對細胞核進行復染,約 30 s。
10)用 PBS 清洗蓋玻片,然后倒置在已經滴有一滴 Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封 片劑,然后用指甲油*封片。此法制備的標本玻片可置于 4℃避光保存,通常 6 個月內可繼續做 F-actin 染色分析。
【注】也可以直接使用含有 DAPI 的抗熒光淬滅封片劑(貨號:36308ES11)合并步驟 9)10),簡化步驟。
11)熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進行熒光觀察,選擇 TRITC 激發/發射濾片(Ex/Em=545/570 nm)和 DAPI 激發/發射濾 片(Ex/Em=364/454 nm)。