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TRIeasy總RNA提取試劑(TRIeasy Total RNA Extraction Reagent)

TRIeasy^TM Total RNA Extraction Reagent是一種適用于各種動植物、細菌組織、細胞的總RNA抽提試劑，具有*的裂解能力，可在短時間內裂解細胞和組織樣本，并有效抑制樣本中RNA的降解，保持RNA的完整性。樣品在該試劑中能夠充分裂解，之后加入氯仿離心分層，形成上清層、中間層和有機層(鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經異丙醇沉淀便可得到總RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質及基因組DNA，可直接用于Northern、點雜交、mRNA純化、體外翻譯、RT-PCR、poly(A)+選擇、RNA酶保護分析以及構建cDNA文庫等多種分子生物學實驗。

此外，樣品中的DNA和蛋白也能以沉淀的方式還原。乙醇沉淀能析出中間層的DNA，而在有機層中加入異丙醇能沉淀出蛋白。

本品操作簡單快速，所有操作可在一小時內完成。對少量的組織(50-100 mg)和細胞(5×106)以及大量的組織(≥1 g)和細胞(>107)均有較好的裂解效果。

運輸與保存方法

冰袋運輸。4℃避光保存，有效期一年。

注意事項
1. 本產品中含有苯|酚，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內、接觸皮膚、吞食等會引起中毒、灼傷及其他身體傷害。使用時應穿戴防護物，如防護|服裝、手套、眼罩、面罩等。如果不小心接觸到眼睛時，應立即用大量的水沖洗并前往醫院治療。

2. 請穿實驗服并佩戴一次性手套操作，避免RNase污染。

3. 需自備氯仿、異丙醇（新開封或提取RNA專用）、75%乙醇 (DEPC處理水配制)、DEPC和DEPC處理水。

4. 樣品用Total RNA Extraction Reagent勻漿后，如果不加入氯仿進行下游實驗，可先-70℃凍存，可保存一個月以上。

5. RNA沉淀在75%乙醇中，4℃可保存1周，-20℃可保存1年。

6. RNA半衰期比較短，易降解，建議抽提后盡快進行后續實驗。

參考用量

表1 每毫升Total RNA Extraction Reagent能夠充分裂解的最大樣本量

注：過多的樣本量可能會導致裂解不充分，并使產物純度降低。

操作流程

1. 樣品的處理

1) 樣品勻漿

A. 貼壁細胞

棄去培養液，直接往直徑3.5 cm的培養板中加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，覆蓋并反復吹打裂解細胞。

注：1. 依據培養板的面積而不是細胞的數量來決定Total RNA Extraction Reagent的所需量（每10 cm2 加1 mL）。

2. 加入Total RNA Extraction Reagent量不足時，會導致DNA污染。

3. 貼壁細胞往往不能*從培養瓶（皿）脫落，這并不意味著裂解不*。此時，細胞膜實際已*裂開，并釋放RNA，繼續后續實驗即可。

B. 懸浮細胞

離心收集細胞沉淀，每5×106-1×107個細胞加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，用移液器反復吹打。

注：加入Total RNA Extraction Reagent前應避免洗滌細胞，否則會增加mRNA降解的可能性。裂解某些酵母和細菌可能需要使用勻漿器。

C. 動、植物組織

取-70℃凍存動物組織在液氮中充分研磨，按照表1加入適當量Total RNA Extraction Reagent混勻。或取新鮮動植物組織盡量剪碎，加入適當量Total RNA Extraction Reagent，勻漿儀進行勻漿處理。

注：樣品體積不要超過加入Total RNA Extraction Reagent體積的10%。

2) 將勻漿樣品劇烈震蕩后在室溫條件下放置5分鐘以使核蛋白體*解離。

3) （可選）4℃，12000 g 離心10 min，取上清。

注：離心可去除樣品中較多蛋白質、脂肪、多糖或肌肉，植物的塊莖結節等。離心后的沉淀中包含有細胞外膜、多糖以及高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織樣品時，上層是大量油脂應盡量去除，取澄清的勻漿液進行后續實驗。

2 總RNA提取
1) 向上述裂解液中加入1/5體積氯仿（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.2 mL氯仿）。蓋緊離心管蓋，劇烈震蕩15 sec，室溫靜置2-3 min。

2) 4℃，12000 g 離心10-15 min。

注：1. 離心后混合物可分3層：上層無色水樣層，中間層，下層紅色有機苯|酚氯仿層。RNA存在于水樣層中。
      2. 上層容量約為所加Total RNA Extraction Reagent總量的50-60%。如加入1 mL Total RNA Extraction Reagent，上層水相約為500-600 μL。建議吸取400-500 μL，以防吸到中間層造成DNA污染。
      3. 有機相和中間層是蛋白和DNA，可用于后續抽提。
3) 小心吸取上層水相至新離心管中，加入1/2體積異丙醇（如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入0.5 mL 異丙醇）。顛倒混勻后室溫放置10 min。

4) 4℃，12000 g 離心10 min。

注：RNA沉淀在離心前通常不可見，離心后在管側和管底形成膠狀沉淀。
5) 小心棄去上清，加入等體積 75%乙醇（DEPC水配制，如每1 mL Total RNA Extraction Reagent加入1 mL 75%乙醇）。渦旋充分洗滌，并輕彈管底，讓沉淀懸浮起來。

6) 4℃，7500 g 離心5 min，棄上清，注意不要丟失RNA沉淀。

注：剩余的少量液體可短暫離心，然后用槍頭吸出，注意不要吸到沉淀。

7) 室溫放置空氣干燥5-10 min。加入30-100 μL 無RNase水溶解RNA，待*溶解后，取少量檢測，其余溶液-70℃保存。

注：RNA沉淀不能*干燥，過分干燥會導致RNA溶解度降低。

3 產物檢測

A. RNA完整性檢測

1) 取1 μL RNA加入適當RNA loading buffer，混勻。

2) 進行電泳檢測。若出現清晰的三條帶，證明RNA完整性較好。

B. RNA純度檢測

檢測260 nm，280 nm OD值，并計算A260/A280比值。純的RNA的比值應在2.0左右。

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