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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 1ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 11203ES03 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 儲存 | 價格（元） | *（元） |
Hieff® qPCR SYBR Green Mix(實時熒光定量) (High Rox Plus) | 11203ES03 | 1ml | -20℃避光 | 180.00 | 180.00 |
11203ES08 | 5×1ml | -20℃避光 | 740.00 | / |
產品描述
Hieff® qPCR SYBR Green Mix(實時熒光定量)(High Rox Plus)是2×實時定量PCR擴增的預混合溶液。Mix中含有熱啟動Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+及High Rox。使用時，僅需在擴增體系中加入模板和引物即可進行實時熒光定量PCR，大大簡化操作過程，降低污染幾率。
本品采用的DNA聚合酶配體可以隨溫度變化實時調節DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特異性PCR擴增的因子和提升PCR反應擴增效率的因子，使定量PCR可以在寬廣的定量區域內獲得良好的線性關系。
適用機型
Applied Biosystems: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT FAST, StepOne, StepOne Plus.
運輸與保存方式
冰袋運輸。-20℃避光儲存，有效期18個月。
本品避免反復凍融。產品中含有熒光染料SYBR Green I，保存或配制反應體系時需避免強光照射。
注意事項
1. 解凍后Master Mix可能出現絮狀物質，4℃放置并上下顛倒混勻至溶液澄清，不影響試劑性能。
2. 推薦使用本公司cDNA合成試劑盒（貨號：11123ES），以有效去除RNA樣品中殘留的基因組。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。
4.本產品僅作科研用途！
反應體系（推薦冰上配置）
組分 | 體積（μl） | 體積（μl） | 終濃度 |
Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (High Rox Plus) | 25 | 10 | 1× |
Forward Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
Reverse Primer (10μM) | 1 | 0.4 | 0.2μM |
模板DNA | X | X | - |
無菌超純水 | to 50 | to 20 | - |
【注】： 使用前務必充分混勻，避免劇烈震蕩產生過多氣泡。
a) 引物濃度：通常引物終濃度為0.2μM，也可以根據情況在0.1-1.0μM之間進行調整。
b) 模板濃度：如模板類型為未稀釋cDNA原液，使用體積不應超過qPCR反應總體積的1/10。
c) 模板稀釋：cDNA原液建議5-10倍稀釋，最佳模板加入量以擴增得到的CT值在20-30個循環為好。
d) 反應體系：推薦使用20μl或50μl，以保證目的基因擴增的有效性和重復性。
e) 體系配制：請于超凈工作臺內配制，并使用無核酸酶殘留的槍頭、反應管；推薦使用帶濾芯的槍頭。避免交叉污染和氣溶膠污染。
擴增程序 （兩步法）
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 5min | 1 |
變性 | 95℃ | 10sec | 40 |
退火/延伸 | 60℃ | 30sec★ | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
擴增程序（三步法）
循環步驟 | 溫度 | 時間 | 循環數 |
預變性 | 95℃ | 5min | 1 |
變性 | 95℃ | 10sec | 40 |
退火 | 55-60℃ | 20sec | |
延伸 | 72℃ | 20sec★ | |
熔解曲線階段 | 儀器默認設置 | 1 | |
【注】高特異性可選擇兩步法，高效率擴增可選擇三步法。
a) 預變性時間：根據不同模板和引物的具體情況可適當縮短至2min。
b) 退火溫度和時間：請根據引物和目的基因的長度進行調整。
c) 熒光信號采集（★）：請按照儀器使用說明書要求進行實驗程序設置，幾種常見儀器的時間設定如下：
30sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science: LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96
31sec以上：Applied Biosystems: 7300
34sec以上：Applied Biosystems: 7500
d) 熔解曲線：通常情況下可以使用儀器默認程序。
結果分析
定量實驗至少需要三個生物學重復。反應結束后需要確認擴增曲線及熔解曲線。
1) 擴增曲線：標準擴增曲線為S型。
Ct值落在20-30之間時，定量分析最準確；
Ct值小于10，需要將稀釋模板后，重新進行實驗；
Ct值介于30-35之間時，需要提高模板濃度，或者增大反應體系的體積，以提高擴增效率，保證結果分析的準確性；
Ct值大于35時，檢測結果無法定量分析基因的表達量，但可用于定性分析。
2) 熔解曲線：
熔解曲線單峰，表明反應特異性好可以進行定量結果分析；若熔解曲線出現雙峰或者多峰，則不能進行定量分析。
熔解曲線出現雙峰，需要通過DNA瓊脂糖凝膠電泳判斷非目標峰是引物二聚體還是非特異性擴增。
如果是引物二聚體，建議降低引物濃度，或者重新設計擴增效率高的引物。
如果是非特異性擴增，請提高退火溫度，或者重新設計更高特異性的引物。
引物設計指南
1. 推薦引物長度25bp左右。擴增產物長度150bp為佳，可以在100bp-300bp內選擇。
2. 正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超過2℃。引物Tm值60℃-65℃為佳。
3. 引物堿基分布要均勻，避免出現連續的4個相同堿基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一個堿基最好為G或C。
4. 引物內部或者正反兩條引物間最好避免出現有3個堿基以上的互補序列。
5. 引物特異性需要用NCBI BLAST程序進行核對。避免引物3’端有2個堿基以上的非特異性互補。
6. 設計完成的引物需要進行擴增效率的檢測，只有具備相同擴增效率的引物才可用于定量比較分析。
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