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翌圣生物科技（上海）股份有限公司
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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 100 μL |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 20585ES01 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
| 主要用途 | 用于帶有Flag標簽的融合蛋白免疫沉淀（IP）和純化 |
產品介紹
產品描述
Anti-Flag親和純化凝膠（Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel）由高質量的鼠源IgG2b單克隆抗體與Sepharose 4B gel通過供價偶聯制備，本產品具有較高的Flag標簽融合蛋白加載容量（至少為1.1 mg protein/mL凝膠），雜蛋白非特異結合少，可用于帶有Flag標簽的融合蛋白免疫沉淀（IP）和純化。
Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel（Anti-Flag親和純化凝膠）可結合Met修飾的N端Flag融合蛋白（Met-FLAG–Protein），N端Flag融合蛋白（FLAG–Protein），C端Flag融合蛋白（Protein-FLAG）。
產品性質
克隆號（Clone） | 1E6 |
亞型（Isotype） | Mouse IgG2b |
純化方法（Purity） | Protein A |
抗體濃度（Antibody Concentration） | 7.5 g抗體/L凝膠 |
應用（Application） | 蛋白純化, 免疫沉淀（IP） |
蛋白結合量（Protein） | ≥1.1 mg蛋白/mL凝膠 |
儲存緩沖液（Buffer） | 10mM Na3PO4，150mM NaCl，50%甘油，pH7.4，含有0.02%（w/v）疊氮鈉 |
運輸和保存方法
冰袋運輸。未開封的產品在-20℃下可穩定保存1年。禁止在不含甘油的溶液中凍存！
注意事項
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產品僅作科研用途！
使用方法
一、制備細胞裂解液（以哺乳動物細胞為例）
注意：樣品中不能含有顆粒不溶物，可以用0.22 μm濾膜過濾或10,000×g離心15 min；如有必要，可以加入蛋白酶抑制劑；如樣品太粘稠，可以加入核酸酶處理。
細胞密度70-90%，100 mm培養皿（約106-107細胞），加入1mL裂解液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl，1 mM EDTA，1%Triton X-100）。推薦加入蛋白酶抑制劑Cocktail（Cat 20123ES）。
1）清洗細胞
貼壁細胞：去除生長培養基，用PBS洗2次，去除PBS，加入裂解液（106-107 cells/mL）。
懸浮細胞：細胞轉移到離心管中，420×g離心5 min，去除上清。用PBS重懸，420×g離心5 min，重復1次，去除上清，
加入裂解液重懸（106-107 cells/mL）。
2）加入裂解液后，孵育15-30 min。
3）離心，12,000×g，10 min。【貼壁細胞離心前先把細胞刮下來】
4）收集上清到預冷的樣品管中。上清可儲存在-70℃。
二、應用
可以使用層析柱或免疫沉淀（IP）純化目的蛋白。1-3 mL凝膠層析柱可以純化約100 mL細胞裂解液；如樣品體積較小（1-2 mL細胞裂解液），可以使用免疫沉淀（IP）法；如需處理較大體積細胞裂解液，推薦使用溶液體系。
1 層析柱法
1.1 裝柱
1）準備層析空柱（Cat 20520ES-20526ES）；用2-3倍柱體積的TBS（50 mM Tris-HCl，pH 7.4，150 mM NaCl）或其他適合緩沖液洗柱2次。
2）顛倒混勻Anti-Flag親和純化凝膠，保證凝膠均一。取1-3 mL凝膠裝柱（純化約100 mL細胞裂解液）。
3）用2-3倍柱體積的TBS洗2次，待液體流盡后，用3倍體積的0.1 M Gly-HCl，pH 3.5沖洗，要保證凝膠平面平整。Gly-HCl緩沖液處理時間不要超過20 min。
4）用5倍體積TBS平衡凝膠柱，直至流出液達到中性pH。
1.2 純化
1）上樣：在層析柱中加滿蛋白裂解液，重復上樣2-3次可以盡可能增加蛋白與凝膠結合量。
2）清洗：用10-20倍柱體積的TBS清洗，以去除非特異結合的蛋白。
3）洗脫（可選以下2種方法之一）：
A、酸洗脫：收集管中加入15-25 μL 1 M Tris，pH 8.0，分別用1 mL 0.1 M Gly-HCl，pH 3.5洗脫，再重復5次。
B、3×Flag多肽（Cat 20571ES）洗脫：用TBS配制Flag多肽溶液（100 μg/mL）洗脫，分別用1倍柱體積多肽溶液洗脫，重復4次。
1.3 填料再生與保存
1）柱再生：使用后立即再生，用3倍柱體積0.1 M Gly-HCl，pH3.5清洗，立即用TBS平衡，直至達到中性pH.
2）保存：用10倍柱體積TBS（含50%甘油，0.02%疊氮鈉）清洗，再加入5 mL該溶液至柱中，保存在2-8℃或-20℃中。
2 免疫沉淀（IP）
2.1 免疫沉淀（IP）
1）充分重懸Anti-Flag親和純化凝膠，盡量形成均一的溶液。取40 μL混合液（20 μL gel）至新的離心管中。
2）5,000-8,200×g離心30 s，使凝膠沉淀在離心管底部，在加入樣品前，靜置1-2 min。去除上清，此時要小心操作，避免吸到凝膠。
3）加入500 μL TBS，輕輕的重懸Anti-Flag Affinity Gel，10,000 rpm離心30 s，棄上清，重復上述步驟1次。
4）可選步驟。為去除凝膠中痕量的未結合抗體，可加入500 μL 0.1 M glycine HCl，pH 3.5清洗凝膠，離心去除上清，加入3倍體積TBS，輕搖2-3分鐘，5,000-8,200×g離心30 s，棄上清，重復洗滌至上清pH為中性。Glycine HCl處理時間切勿超過20 min。
5）加入200-1000 μL細胞裂解液，如有必要，可用裂解液調整至終體積1 mL。細胞裂解液的體積取決于Flag融合蛋白的表達量。陽性對照，需要加入1 mL TBS和4 μL 50 ng/μL Flag-BAP融合蛋白（約200 ng）；陰性對照，只要加入1 mL裂解緩沖液即可（不含蛋白）。
6）4℃緩慢孵育2小時。如需提高結合效率，可延長至過夜。
7）5,000-8,200×g離心30 s，去除上清。
8）上述沉淀用0.5 mL TBS，輕搖混勻，5,000-8,200×g離心30 s去盡上清，重復3次。
2.2 Flag融合蛋白洗脫（可選以下3種方法之一）
1）非變性洗脫（3×Flag多肽）
a. 配制3×Flag多肽洗脫液：用0.5 M Tris-HCl溶液，pH 7.5（含1M NaCl）溶解3×Flag多肽，終濃度為25 μg/μL。用ddH2O稀釋至5 μg/μL，加入3 μL 5 μg/μL的3×Flag多肽，加入到100 μL TBS中（終濃度150 ng/μL）。
b. 分別加入100 μL 3×Flag多肽洗脫液，4℃孵育30 min（慢慢搖晃），5,000-8,200×g離心30 s，轉移上清至新管中（不要吸到凝膠）。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃長期保存。
2）酸性洗脫（0.1 M Gly-HCl，pH 3.5）
加入100 μL 0.1 M Gly-HCl，pH 3.5，室溫孵育5 min（慢慢搖晃），5,000-8,200×g離心30 s，轉移上清至新管中（含10 μL 0.5 M Tris-HCl，pH 7.5，1.5 M NaCl）。注意不要吸到凝膠。如立即使用，上清可保存在4℃，-20℃長期保存。
3）用SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫
加入20 μL 2×上樣緩沖液（125 mM Tris-HCl，pH 6.8，4% SDS，20%甘油，0.004%溴酚藍），煮沸3 min，5,000-8,200×g離心30 s。上清可直接SDS-PAGE電泳，或WB檢測。
2.3 填料再生與保存
1）再生：使用后立即再生，加入3倍凝膠體積0.1 M Gly-HCl，pH3.5，輕搖3-5 min，5,000-8,200×g離心30 s，棄上清。立即用TBS平衡：加入3倍體積TBS，輕搖2-3 min，5,000-8,200×g離心30 s，收集上清測定pH，如為中性（原TBS加入前pH），則進行下一步，如仍為酸性，則重復平衡步驟。
2）保存：用10倍凝膠體積TBS（含50%甘油，0.02%疊氮鈉）清洗，再加入適量該保存溶液至填料中，保存在2-8℃或-20℃中。保存緩沖液添加量，恢復至純化前即可，體積比膠:緩沖液=1:1，可以增大緩沖液體積，緩沖液主要是提供必要的pH值和避免-20℃結冰。
3 溶液體系
1）調整蛋白裂解液pH至pH 7-8，含有0.15 M鹽離子，如NaCl，可以降低非特異性蛋白結合。需去除Flag融合蛋白裂解液中的不溶成分。
2）重懸Anti-Flag親和純化凝膠，轉移至新離心管中。3倍體積TBS，輕搖2-3 min，5,000-8,200×g離心30 s，棄上清，重復洗滌至上清pH為中性。
3）Flag融合蛋白裂解液與Anti-Flag親和純化凝膠孵育1 h，在孵育過程中輕搖，以保證蛋白與凝膠充分接觸。可根據情況，調整孵育時間。
4）1,000×g離心5 min收集凝膠-Flag融合蛋白；
5）用10-20倍柱體積的TBS清洗凝膠，以去除非特異蛋白。
6）洗脫Flag融合蛋白【參照上述洗脫步驟】。
7）填料再生和保存【參照上述步驟】。
實驗提示：
1）酸性洗脫時，Gly-HCl緩沖液處理時間不要超過20 min。
2）上樣緩沖液中不要加入還原劑（如DTT），還原劑會破壞抗體，如必須要加還原劑，則2×上樣緩沖液中還原劑不能超過10%或100 mM。
3）上樣緩沖液中SDS會破壞抗體，所以Anti-Flag親和純化凝膠不能重復使用。
4）純化推薦將凝膠裝入層析柱中，所有溶液可以直接流過。若在管中，需反復離心除去溶液，操作繁瑣。
5）除樣本和裂解液外，其它溶液建議3倍體積，重復3次。可在保證純化效果基礎上適當縮減重復次數。
6）建議同時做陽性與陰性對照組。
HB230112
