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產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit是新一代的同源重組克隆試劑盒，精心優(yōu)化的2×Hieff Clone® Universal Enzyme Premix預混了重組酶和重組反應所需緩沖液，并添加了*的重組增強因子，可顯著提高重組克隆效率。

該試劑盒可以將PCR產(chǎn)物定向克隆至任何載體的任何位點，濃度可低至5 ng/μL，一次可實現(xiàn)多至6個片段的順序拼接克隆。將載體線性化，并在插入片段正、反向PCR引物5’端引入15-25 bp的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。PCR產(chǎn)物和線性化載體在重組酶的作用下，僅需50℃，5-15 min即可完成重組反應。克隆陽性率可達95%以上。

產(chǎn)品組分

產(chǎn)品應用

快速克隆；定向克隆；定點突變。

運輸與保存方式

冰袋運輸。-20℃保存，有效期1年。

注意事項

1. 需自備的材料：

1）自備樣品：自備好線性化載體和插入片段。

2）自備試劑（僅羅列部分）：

① 超級感受態(tài)：轉(zhuǎn)化效率＞108 cfu/μg，如翌圣DH5α超級感受態(tài)細胞（Cat#11802）；

② 高保真酶： 2×Hieff Canace® Gold PCR Master Mix（Cat#10149）或其他等效產(chǎn)品；

③ 菌落PCR mix：2×Hieff® Robust PCR Master Mix（With Dye)（Cat#10106）或其他等效產(chǎn)品；

④ 核酸染料：YeaRed Nucleic Acid Gel Stain (10,000 × in Water)（Cat#10202）或其他等效產(chǎn)品；

3）自備儀器耗材（僅羅列部分）：PCR儀，水平電泳槽，切膠儀，EP管等；

2. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并佩戴一次性手套操作。

3. 本產(chǎn)品僅作科研用途！

簡版操作步驟

一、重組反應

1.線性化載體與插入片段使用量

Hieff Clone® 重組反應體系最適片段及載體插入總體積為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對應的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：

pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5000 bp的DNA段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA段約為0.15 pmol

【注】：當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應互換，即插入片段當做載體，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的使用量低可達到5 ng。線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

2.重組反應體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

3.重組反應條件

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。

2）當插入1個片段并且DNA總量＜300 ng時，建議反應條件為50℃，5 min；當插入片段數(shù)為2-4個時，建議反應條件為50℃，15 min；當插入片段數(shù)為5-6個時，建議反應條件為50℃，30 min。

建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進行反應。

3）反應產(chǎn)物可直接進行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

二. 重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化、涂板

1）在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。

2）取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。

3）42℃熱激50 sec，冰浴孵育1-2 min。

4）加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。

5）5000 rpm離心3 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

樣本制備

單片段同源重組

一. 實驗流程

圖1 Hieff Clone® 單片段同源重組實驗流程圖

二. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。建議盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴增獲得。

1.酶切制備線性化載體

1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。

2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。

【注】：不含插入片段的假陽性克隆可能是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預混液，Cat#10154）進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone® 重組反應體系兼容幾乎所有酶切反應體系和常規(guī)PCR反應體系，當載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進行重組反應。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化載體進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。 

三. PCR擴增制備插入片段

1.設計擴增引物

Hieff Clone® 引物設計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。

插入片段正向擴增引物設計方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+基因特異性正向擴增引物序列—3’

插入片段反向擴增引物設計方式：

3’—基因特異性反向擴增引物序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：①基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；

②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。

推薦使用翌圣無縫克隆引物設計軟件（122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴增引物。若手動設計，可參照以下實例。

圖2 插入片段引物設計方案

【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進行引物合成。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴增

插入片段擴增可用任意PCR酶擴增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進行擴增（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預混液，Cat#10154）。

PCR擴增結束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此，如果擴增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應。但PCR擴增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。 

多片段同源重組

一. 實驗流程

圖3 Hieff Clone® 多片段同源重組實驗流程圖

二. 制備線性化載體

選擇合適的克隆位點，并對載體進行線性化。建議盡量選擇無重復序列且GC含量均勻的區(qū)域進行克隆。載體克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)最佳。線性化載體可通過限制性內(nèi)切酶酶切或反向PCR擴增獲得。

1.酶切制備線性化載體

1）雙酶切線性化：線性化*，轉(zhuǎn)化背景低。建議使用。

2）單酶切線性化：線性化程度較差。可適當延長酶切時間以降低轉(zhuǎn)化背景。

【注】：不含插入片段的假陽性克隆可能是由未線性化環(huán)狀載體轉(zhuǎn)化而形成的。若這種假陽性克隆比例較高，建議重新制備線性化載體。

2.反向PCR擴增制備線性化載體

建議使用高保真聚合酶（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預混液，Cat#10154）進行載體擴增，以減少擴增突變的引入。PCR擴增模板應盡量使用預線性化質(zhì)粒，以防止殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板對克隆陽性率的影響。

Hieff Clone® 重組反應體系兼容幾乎所有酶切反應體系和常規(guī)PCR反應體系，當載體酶切產(chǎn)物或反向PCR擴增產(chǎn)物純度較高時，可以無需純化，直接進行重組反應。但純度較低且有可能含有未線性化環(huán)狀質(zhì)粒時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化載體進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀載體，有利于提高重組效率。

三. PCR擴增制備插入片段

1.設計擴增引物

Hieff Clone® 引物設計方式：通過在插入片段正、反向PCR引物的5’端引入15-25 bp（不包括酶切位點）的線性化載體末端同源序列，使得插入片段PCR產(chǎn)物5’和3’末端分別帶有與線性化載體兩末端對應的*一致的序列。

推薦使用翌圣無縫克隆引物設計軟件（//122.112.245.84:8080/hieff-clone/），自動生成插入片段的擴增引物。若手動設計，可參照以下實例。以在pUC18載體的EcoR I 和Hind III 酶切位點間插入三段基因的引物設計為例，引物具體設計方案如下：

首先設計第一片段的正向擴增引物和第三片段的反向擴增引物(與載體相鄰的兩個插入片段)。

第一片段正向擴增引物設計方式：

5’—上游載體末端同源序列+酶切位點（可保留或刪除）+第一片段基因特異性正向擴增序列—3’

第三片段反向擴增引物設計方式：

3’—第三片段基因特異性反向擴增序列+酶切位點（可保留或刪除）+下游載體末端同源序列—5’

【注】：①基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；

②上游/下游載體末端同源序列為線性化載體最末端序列（用于同源重組），GC含量40%-60%為佳。

圖4 與載體相鄰的兩個插入片段引物設計方案

其次設計第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物。用于片段之間進行重組的同源序列可以添加至前方片段的反向擴增引物中，也可以添加至后方片段的正向擴增引物中，還可以兩片段各添加一部分。以將同源序列添加至前方片段 （第一片段）的反向擴增引物中為例，引物具體設計方案如圖5所示：

第一片段反向擴增引物設計方式：

3’—第一片段基因特異性反向擴增序列+第二片段5’端同源序列—5’

第二片段正向擴增引物設計方式：

5’—第二片段基因特異性正向擴增序列—3’

【注】：①基因特異性正/反向擴增序列即常規(guī)插入片段正/反向擴增引物序列；

②第二片段5’端同源序列即用于第一片段與第二片段進行重組的添加序列。

最后設計第二片段的反向擴增引物和第三片段的正向擴增引物。設計方式與第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計方式一致。具體方案參見圖5。

圖5 第一片段的反向擴增引物和第二片段的正向擴增引物設計方案

【注】：最終引物長度超過40 bp，建議選用PAGE純化方式進行引物合成。計算擴增引物退火溫度時，只需計算基因特異性擴增序列的Tm值，載體末端同源序列不應參與計算，為了得到高效率克隆，建議Tm≥48℃。

2.插入片段PCR擴增

插入片段擴增可用任意PCR酶擴增，無需考慮產(chǎn)物末端有無A尾 (重組過程中將被去除，在最終載體中不會出現(xiàn))。但為了減少擴增突變的引入，建議使用高保真聚合酶進行擴增（如：2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix (With Dye) 高保真酶預混液，Cat#10154）。

PCR擴增結束后，取少量產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳以檢驗擴增產(chǎn)量和特異性。Hieff Clone®重組反應體系兼容常規(guī)PCR反應體系。因此，如果擴增模板不是與載體抗性相同的環(huán)狀質(zhì)粒，且PCR產(chǎn)物電泳條帶單一，則擴增產(chǎn)物可以無需純化，直接用于重組反應。但PCR擴增產(chǎn)物純度較低時，建議使用高質(zhì)量的試劑盒對PCR擴增產(chǎn)物進行膠回收純化，以提高產(chǎn)物純度，有利于提高重組效率。

濃度測定

推薦使用瓊脂糖凝膠電泳比較條帶亮度的方法對DNA進行定量。將線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物做數(shù)個等體積稀釋梯度，原始產(chǎn)物和稀釋后產(chǎn)物各取1 μL進行瓊脂糖凝膠電泳，與DNA分子量標準（DNA Marker）比較條帶亮度以確定其近似濃度（尤其針對于線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化的情況）。也可通過核酸濃度測定儀對線性化載體和插入片段進行測定，記錄濃度值（ng/μL）和OD260/OD280值后進行投入量的計算。

重組反應

1.線性化載體與插入片段使用量

Hieff Clone® 重組反應體系最適片段及載體插入總體積為0.02-1 pmol，1-3片段為0.02-0.5 pmol，4-6片段為0.5-1 pmol。最適載體與插入片段摩爾比為1:3。對應的DNA質(zhì)量可由以下公式計算獲得：

pmol = (插入片段使用量ng) × 1,000 / (插入堿基對數(shù) × 650 daltons)
50 ng 5000 bp的DNA段約為0.015 pmol
50 ng 500 bp的DNA段約為0.15 pmol

【注】：當插入片段長度大于載體時，最適載體與插入片段使用量的計算方式應互換，即插入片段當做載體，載體當做插入片段進行計算。線性化載體及插入片段的使用量最可達到5 ng。線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。

案例

以插入4片段（P1，P2，P3，P4）總濃度0.5 pmol為例：分別將長度為0.5 kb，1 kb，2 kb和3 kb的插入片段克隆至長度為5 kb的載體時，線性化載體的最適使用量應為：0.025×5000 = 125 ng；插入片段P1最適使用量應為：0.075×500=37.5 ng，插入片段P2最適使用量應為：0.075×1000=75 ng，插入片段P3最適使用量應為：0.075×2000=150 ng，插入片段P4最適使用量應為：0.075×3000=225 ng。

2.重組反應體系（推薦冰上配制，各組分使用前需混勻）

3.重組反應條件

1）體系配制完成后，用移液器輕輕吸打混勻各組分，短暫離心將反應液收集至管底。

2）當插入1個片段并且DNA總量＜300 ng時，建議反應條件為50℃，5 min；當插入片段數(shù)為2-4個時，建議反應條件為50℃，15 min；當插入片段數(shù)為5-6個時，建議反應條件為50℃，30 min。

建議在PCR儀或水浴鍋等溫控精確的儀器上進行反應。

3）反應產(chǎn)物可直接進行轉(zhuǎn)化，也可儲存于-20℃，待需要時解凍轉(zhuǎn)化。

轉(zhuǎn)化涂板

1. 在冰上解凍克隆感受態(tài)細胞（如：DH5α Chemically Competent Cell，Cat#11802）。

2. 取10 μL冷卻重組產(chǎn)物，加入到100 μL感受態(tài)細胞中，輕彈管壁數(shù)下混勻，在冰上放置25 min。

3. 42℃熱激50 sec，冰浴孵育1-2 min。

4. 加入750 μL SOC或LB培養(yǎng)基，37℃孵育2 min充分復蘇。37℃，200 rpm，搖菌60 min。

5. 5000 rpm離心3 min，棄掉750 μL上清。用剩余培養(yǎng)基將菌體重懸，用無菌涂布棒在含有正確抗性的平板上輕輕涂勻。待菌液被吸收，將平板倒置，于37℃過夜培養(yǎng)。

克隆鑒定

方便快捷的方法是菌落PCR。用無菌的槍頭或牙簽將單個菌落挑至20-50 μL LB培養(yǎng)基中混勻，直接取1 μL作為PCR模板。推薦至少用一條通用測序引物進行菌落PCR，這樣可以避免PCR假陽性的產(chǎn)生。后續(xù)也可做酶切或測序鑒定。

常見問答

1、最佳克隆位點選擇？

答：在選擇克隆位點時，應避免選擇克隆位點上下游50 bp內(nèi)有重復序列的區(qū)域。當克隆位點上下游25 bp區(qū)域內(nèi)GC含量均在40%-60%范圍內(nèi)時，重組效率將達到最大。若高于70%或者低于30%，重組效率會受到較大影響。

2、無克隆長出或克隆數(shù)較少？

答：出現(xiàn)該情況，建議使用翌圣陽性對照（Cat#10923），可排除試劑盒本身的影響，并進行進一步判定，主要有以下可能情況：

1）引物設計不合適：推薦【同源序列（15-25 bp）+完整的酶切位點+基因特異性擴增引物】，GC含量40% - 60%。

2）感受態(tài)細胞效率低：使用新鮮制備或妥善凍存的感受態(tài)細胞，確保其轉(zhuǎn)化效率>107 cfu/μg。每次操作時可設置一組轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的對照實驗，以檢測感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化效率。連接產(chǎn)物體積不應超過感受態(tài)細胞體積的1/10，否則會降低轉(zhuǎn)化效率。

3）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物的使用量不足/過量，或者比例不佳：盡量按照推薦的量和比例配制重組反應體系。

4）線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物不純，抑制反應：線性化載體和插入片段擴增產(chǎn)物未純化，直接使用時，使用總體積應不超過反應體系體積的1/5，如20 μL體系不超過4 μL。建議線性化載體、插入片段擴增產(chǎn)物進行凝膠回收純化，純化產(chǎn)物溶解在ddH2O中。

3、出現(xiàn)較多假陽性

答：主要有以下可能情況：

1）載體線性化不*：即使是痕量未*酶切的載體也會產(chǎn)生很高的轉(zhuǎn)化背景。可通過陰性對照檢測載體是否線性化*，優(yōu)化酶切體系，提高限制性內(nèi)切酶使用量、延長酶切反應時間、膠回收純化酶切產(chǎn)物等都可以有效減少環(huán)狀質(zhì)粒殘留。

2）插入片段擴增產(chǎn)物混有非特異擴增產(chǎn)物：建議：①優(yōu)化PCR體系，提高特異性；②膠回收PCR產(chǎn)物；③鑒定更多克隆。 

3）反應體系中混入了相同抗性的質(zhì)粒：PCR擴增模板(載體或插入片段)為環(huán)狀質(zhì)粒時，若擴增產(chǎn)物直接用于重組反應，殘留環(huán)狀質(zhì)粒模板會產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化背景。建議使用預線性化質(zhì)粒作為擴增模板、擴增產(chǎn)物進行DpnI消化或擴增產(chǎn)物進行膠回收純化。

4、菌落PCR無條帶

答：主要有以下可能情況：

1）引物不正確：推薦使用載體的通用引物或至少使用一條通用引物進行菌落PCR檢測。

2）PCR體系或程序不合適：沒有目的條帶也沒有空質(zhì)粒條帶，建議優(yōu)化PCR體系、程序；或者提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒做模板PCR驗證；或者進行酶切驗證。

3）重組失敗：沒有目的條帶，只有空質(zhì)粒的條帶，說明重組不成功，載體線性化不*，建議優(yōu)化酶切體系。

HB220311