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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 1ml |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 20561ES03 | 應用領域 | 醫療衛生,化工,生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格（元） |
HisSep Ni-NTA MagBeads His標簽蛋白純化磁珠 | 20561ES03 | 1 mL | 198.00 |
20561ES08 | 5 mL | 598.00 |
產品描述
His-tag蛋白純化磁珠是一種高容量的新型磁性微球產品，用于快速、高效的純化 His標簽融合蛋白。磁珠在磁場作用下直接從生物樣品中可一步純化出高達95%純度的目的蛋白，極大的簡化了純化工藝和提高純化效率。將含有His標簽蛋白的細胞裂解物添加到MagBeads 中，讓蛋白質與其充分結合，然后可從磁珠中洗脫分離出目的蛋白。
與傳統柱層析方法相比，使用磁珠純化His標簽蛋白無需控制上樣流速和多次離心樣品，也不需要昂貴的層析和離心設備。樣品與磁珠的結合以及目的蛋白與磁珠的分離簡單、快捷，而且更容易實現高通量、自動化的蛋白純化方法。適合科研和工業客戶高通量地進行標簽蛋白的純化。
該磁珠以4%瓊脂糖凝膠為基質通過化學方法偶聯了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合鎳離子(Ni2+)后，可以形成非常穩定的八面體結構，鎳離子處于八面體的中心，這樣的結構很有效的保護了鎳離子免受小分子的進攻更加穩定。
His標簽蛋白純化磁珠廣泛適用于細菌、酵母、昆蟲和哺乳動物細胞等分泌或胞內表達的可溶性標簽蛋白，也可用于變性蛋白的純化（包涵體需變性后再進行純化）。
產品性質
基質 | 磁性瓊脂糖微球 |
載量 | > 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠 |
粒徑 | 30-100 μm |
磁珠濃度 | 磁珠懸浮于保護液中，含量為20%（V/V) |
儲存緩沖液 | 含20%乙醇的1×PBS |
運輸和保存方法
冰袋運輸。4℃長期儲存，有效期2年。
注意事項
1.磁珠保存過程中避免冷凍、干燥和高速離心等操作。
2.磁珠使用前，請充分震蕩，使磁珠保持均勻的懸浮狀態。
3.使用過的磁珠重復使用時，建議純化同一種蛋白，純化不同種蛋白時，建議使用新磁珠，以避免交叉污染。
4.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
5.本產品僅作科研用途！
使用方法
一、緩沖液配制
1.緩沖液使用基本原理：低咪唑上樣，高咪唑洗脫，或者高pH上樣，低pH洗脫。
2.Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
3.可溶性蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表1，包涵體蛋白純化所需緩沖液及配方詳見附表2和表3。
二、樣本制備
2.1細菌或酵母表達的蛋白
1）將培養液轉移到離心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，離心15 min收集菌體，然后按照菌體：Lysis Buffer=1: 10 （W/V）加入Lysis Buffer，加入終濃度為1 mM的PMSF。同時可加入其他蛋白酶抑制劑，但不能影響目的蛋白與磁珠的結合。
2）加入,使其工作濃度為0.2-0.4 mg/mL。如果表達的宿主細胞內含pLysS或pLysE，可以不加。
3）將菌體沉淀懸浮起來，（如果菌液濃度高，也可考慮加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I）,混勻，冰上超聲破碎細胞，至菌液基本保持澄清。
4）將澄清的破碎液轉移至離心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃離心20-30 min。 取上清，置于冰上備用或-20℃保存。
2.2酵母、昆蟲和哺乳細胞分泌表達可溶性蛋白
1）將細胞培養液轉移至離心杯中，5,000 rpm (3,800 xg)，離心10 min，收集菌體得上清，如上清中不含EDTA、和還原劑等物質，即可直接使用；如含有EDTA、和還原劑等物質，需用Lysis Buffer透析才能上樣。
2）對于大量體積的上清，需加入硫酸銨沉淀濃縮后，然后用Lysis Buffer透析后才能上樣。
2.3包涵體蛋白純化（變性條件）
1）將培養液轉移到離心杯中，7,000 rpm (7,500 xg)，離心15 min收集菌體，去掉上清。
2）按照菌體：Lysis buffer（不含8M尿素）=1:10 (W/V)將菌體懸浮起來，混勻，冰浴超聲破碎。
3）將破碎液轉移至離心管中，10,000 rpm (15,000 xg)，4℃離心20-30 min。去掉上清，步驟2和3可以重復一次。
4）按照菌體：Lysis buffer（含8M尿素）=1:10 (w/v)的比例將包涵體充分懸浮。
三、磁珠預處理
3.1 準備
將磁珠充分混勻，使用移液器取適量的磁珠懸浮液，置于離心管中，將離心管置于磁力架上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄上清。
3.2平衡
將離心管從磁力架上取下來，加入與懸浮液等體積的Lysis Buffer，使用槍頭反復吹打5-10次，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸棄清液，重復洗滌2次。
四、磁珠與目的蛋白結合
4.1 結合
將含有目的蛋白的上清液加入到處理好的磁珠中，顛倒混勻。將離心管置于混合儀上，室溫旋轉孵育30 min （如果目標蛋白不穩定，建議2-8℃下孵育1 h）。
4.2 洗雜
將離心管置于磁分離器，待溶液變澄清后，用移液器移出上清液，保留上清液，以備取樣檢測。向離心管中加入2倍懸浮液體積的Wash Buffer，使用槍頭反復吹打5-10次，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，保留，以備取樣檢測。重復上述步驟2次。
4.3 洗脫
建議將3-5倍磁珠體積的Elution Buffer加入到離心管中，使用移液器輕輕吹打3-5次，混勻，將離心管置于磁分離器上，待溶液變澄清后，用移液器吸取上清液，即為目的蛋白。如有需要，可以重復上述步驟1次，以提高目的蛋白的回收量。用戶也可根據實驗結果調整緩沖液中的咪唑濃度。
五、磁珠保存
1. 向裝有磁珠的離心管中加入1 mL Elution Buffer，用移液器反復吹打3-5次，使磁珠充分懸浮，然后置于磁分離器，吸棄上清，重復該操作2次。
2. 向離心管中加入1 mL去離子水，用移液器反復吹打3-5次，使磁珠充分懸浮，然后置于磁分離器，吸棄上清，重復該操作2次。
3. 向離心管中加入含20%乙醇的1×PBS，使總體積為磁珠初始懸浮液體積，保存于2-8 ℃。
六、SDS-PAGE 檢測
將純化得到的樣品（包括原始樣品、流出組分、洗雜及洗脫組分）使用SDS-PAGE檢測純化效果。
表1. 可溶性His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方
緩沖液名稱 | 配方 | 配制1L溶液所需各種試劑量 |
Lysis Buffer | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 0.68 g
|
Wash Buffer | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 1.36 g
|
Elution Buffer | 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 17.0 g
|
以上緩沖液適用于多數His標簽蛋白的純化，客戶也可根據實驗結果調整緩沖液中的咪唑濃度。
表2. 包涵體His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方,pH洗脫方式
緩沖液名稱 | 配方 | 配制1L溶液所需各種試劑量 |
Lysis Buffer | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·H2O 13.80 g Tris·Cl 12.10 g
|
Wash Buffer | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·H2O 13.80 g Tris·Cl 12.10 g |
Elution Buffer | 8 M Urea 100 mM NaH2PO4 100 mM Tris·HCl 鹽酸溶液調pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·H2O 13.80 g Tris·Cl 12.10 g |
表3. 包涵體His標簽蛋白純化所需緩沖液及配方,咪唑洗脫方式
緩沖液名稱 | 配方 | 配制1L溶液所需各種試劑量 |
Lysis Buffer | 8 M Urea 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 0.68 g |
Wash Buffer | 8 M Urea 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 1.36 g |
Elution Buffer | 8 M Urea 50 mM NaH2PO4 300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH調pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm過濾除菌 | Urea 480.50 g NaH2PO4 ·2H2O 7.80 g NaCl 17.54 g Imidazole 17.0 g |
表4. Ni NTA Magarose Beads試劑耐受情況
試劑種類 | 濃度 |
還原劑 | 5 mM DTE 1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione |
變性劑 | 8 M urea 6 M Gua-HCl |
去污劑 | 2% TritonTM X-100, nonionic 2% TweenTM20, nonionic 2% NP-40, nonionic 2% Cholate, anionic 1% CHAPS, zwitterionic |
其他類 | 500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na2SO4 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate |
HB220315
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