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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 規格 | 8t |
|---|---|---|---|
| 貨號 | 12197ES08 | 應用領域 | 生物產業 |
產品介紹
產品信息
產品名稱 | 產品編號 | 規格 | 價格 |
Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for Illumina® V2 全能型DNA建庫試劑盒V2 | 12197ES08 | 8 T | 2755.00 |
12197ES24 | 24 T | 7155.00 | |
12197ES96 | 96 T | 2,5955.00 |
產品描述
Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for Illumina® V2是針對Illumina®高通量測序平臺專業開發設計的新一代建庫試劑盒。本產品采用高質量的酶學組成，在前一代建庫試劑盒的基礎上，改進了DNA片段末端修復和加A效率，同時改善了接頭連接效率。本試劑盒采用新型的高保真酶，顯著提高擴增均一性和保真性，可應用于常規動植物基因組、微生物基因組、FFPE、cfDNA、ChIP DNA等樣本，助力獲得優異的測序數據。
適用100 pg-1000 ng所有DNA樣本，包含cfDNA、FFPE等
業界的文庫轉化率，最高可達70%以上
多樣本驗證可獲得優異的文庫與測序數據
嚴格的批次性能與穩定性質控
全能型DNA建庫試劑盒V2組分
組分編號 | 組分名稱 | 產品編號/規格 | |||
12197ES08 | 12197ES24 | 12197ES96 | |||
12197-A |
| Endprep Buffer 2.0 | 48 μL | 144 μL | 576 μL |
12197-B |
| Endprep Enzyme 2.0 | 32 μL | 96 μL | 384 μL |
12197-C |
| Ligation Enhancer 2.0 | 240 μL | 720 μL | 3×960 μL |
12197-D |
| Rapid T4 DNA Ligase 2.0 | 40 μL | 120 μL | 480 μL |
12197-E |
| Canace® Pro Amplification Mix 2.0 | 200 μL | 600 μL | 4×600 μL |
12197-F |
| Primer Mix | 40 μL | 120 μL | 480 μL |
運輸與保存方法
注意事項
一、關于操作
1. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
2. 請于使用前將試劑盒各組分置于室溫解凍。解凍后上下顛倒數次充分混勻，短暫離心后置于冰上待用。
3. 配制各步驟反應液時推薦使用移液器吹打混勻或輕輕振蕩，劇烈振蕩可能會造成文庫產出下降。
4. 為避免樣品交叉污染，推薦使用帶濾芯的槍頭，吸取不同樣品時請更換槍頭。
5. 推薦在帶熱蓋的PCR儀中進行各步驟反應，使用前應預熱PCR儀至反應溫度附近。
6. PCR產物因操作不當極容易產生氣溶膠污染，進而影響實驗結果準確性。推薦將PCR反應體系配制區和PCR產物純化檢測區進行強制性的物理隔離；使用專用的移液器等設備；并定時對各實驗區域進行清潔（使用0.5%次氯酸鈉或10%漂白劑進行擦拭清理），以保證實驗環境的潔凈度。
7. 本產品僅作科研用途！
二、關于DNA片段化
1. 本試劑盒中兼容機械法及酶切法片段化的DNA。
2. 本試劑盒兼容范圍為100 pg - 1000 ng Input DNA。應盡可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高質量Input DNA。表1中列舉了將本試劑盒應用于常見應用中推薦的Input DNA量。
表1 常見應用中推薦Input DNA量
應用 | 樣本類型 | 推薦Input DNA量 |
全基因組測序 | 復雜基因組 | 50 ng-1000 ng |
靶向捕獲測序 | 復雜基因組 | 10 ng-1000 ng |
全基因組測序，靶向捕獲測序 | FFPE DNA | 50 ng-1000 ng |
全基因組測序，靶向捕獲測序 | cfDNA/ctDNA | ≥500 pg |
全基因組測序 | 微生物基因組 | ≥1 ng |
全基因組測序PCR-free測序 | 高質量DNA | ≥50 ng |
【注】：上表為使用高質量DNA時推薦的Input DNA量，當Input DNA質量較差或需要進行片段分選時，應適當上調使用量。
3. Input DNA特指投入末端修復/dA尾添加步驟中的DNA。
4. Input DNA制備過程中帶入的高濃度金屬離子螯合劑或其他鹽，可能會影響末端修復/dA尾添加步驟反應效率，建議DNA片段化后進行磁珠純化或分選。當使用機械法進行DNA片段化且產物不進行純化或長度分選而直接建庫時，請將DNA稀釋在TE Buffer中進行片段化，請勿在滅菌超純水中進行。
三、關于接頭連接（Adapter Ligation)
1. 針對Illumina®測序平臺，Yeasen提供48種Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®，Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® (Cat#12404~Cat#12407)。
2. Adapter的質量和使用濃度直接影響連接效率及文庫產量。Adapter用量過高可能會產生較多Adapter Dimer；用量較低可能會影響連接效率及文庫產量；使用Adapter時根據Input DNA量用TE Buffer進行相應稀釋。表2列舉了使用本試劑盒的不同Input DNA量推薦的Adapter稀釋方法。
表2 500 pg-1000 ng Input DNA推薦的Adapter使用濃度
Input DNA | Adapter稀釋倍數 | 濃度 |
<5 ng | 20倍稀釋 | 0.75μM |
5 ng ~ 9 ng | 10倍稀釋 | 1.5 μM |
10 ng ~ 24 ng | 5倍稀釋 | 3 μM |
25 ng ~ 49 ng | 2 倍稀釋 | 7.5 μM |
50 ng ~ 1000 ng | 不稀釋 | 15 μM |
四、關于磁珠純化與分選 (Bead-based Clean Up and Size Selection)
1. DNA片段長度分選步驟可選擇在末端修復/dA尾添加之前，或接頭連接后，或文庫擴增后進行。
2. 當Input DNA質量≥50 ng，您可選擇在接頭連接后分選；如Input DNA質量<50 ng，建議您在文庫擴增后進行分選。
3. Ligation Enhancer中包含高濃度的PEG，會對雙輪磁珠分選產生顯著影響。因此，如在接頭連接后進行長度分選，必須先進行純化步驟，再進行雙輪分選步驟；如在末端修復/dA尾添加之前或文庫擴增后進行長度分選，可直接進行雙輪磁珠分選步驟。
4. 磁珠使用前應先平衡至室溫，否則會導致得率下降、分選效果不佳。
5. 磁珠每次使用前都應充分振蕩混勻或使用移液器上下吹打充分混勻。
6. 轉移上清時，請勿吸取磁珠，即使微量殘留都將影響后續文庫質量。
7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇應現用現配，否則將影響回收效率。
8. 進行長度分選時，初始樣品體積應盡量≥100 μL，不足時請用超純水補齊。以防因樣品體積太小導致移液誤差增大。
9. 產物洗脫前應將磁珠置于室溫干燥。干燥不充分容易造成無水乙醇殘留影響后續反應；過分干燥又會導致磁珠開裂進而降低純化得率。通常情況下，室溫干燥3-5 min足以讓磁珠充分干燥。
10. DNA純化或長度分選產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫，產物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1個月。
五、關于文庫擴增 (Library Amplification)
1. 是否需要進行文庫擴增取決于Input DNA量、Adapter是否為完整長度、應用需要等因素。如使用非完整長度Adapter，必須進行這一步驟。如使用完整長度Adapter，當Input DNA<200 ng時，推薦進行文庫擴增；當Input DNA≥200 ng或者不需要進行文庫擴增時，可不進行文庫擴增。
2. 文庫擴增步驟需要嚴格控制擴增循環數。循環數不足，將導致文庫產量低；循環數過多，又將導致文庫偏好性增加、重復度增加、嵌合產物增加、擴增突變積累等多種不良后果。表3列舉了使用本試劑盒，獲得1 μg文庫的推薦循環數。
表3 100 pg-1000 ng Input DNA獲得1 μg產物擴增循環數推薦表
Input DNA | 1μg文庫產量推薦PCR循環數 |
1000 ng | 2 - 4 |
500 ng | 2 - 4 |
250 ng | 4 - 6 |
100 ng | 5 - 7 |
50 ng | 7 - 9 |
10 ng | 9 - 11 |
5 ng | 10 - 12 |
1 ng | 12 - 15 |
100 pg | 17 - 19 |
【注】：
1. 表3為使用200 bp左右的高質量Input DNA測試的循環數參數。FFPE DNA質量差異較大，當DNA質量較差或文庫長度較長時，需適當提高循環數以獲取足量文庫。
2. 如果建庫過程中需要進行過片段分選，推薦較高循環數進行Library Amplification；反之則參照較低循環數即可。
3. 如果使用了不完整的接頭，需要擴增至少2個循環，形成完整的接頭。
六、關于文庫質檢 (Library Quality Analysis)
1. 通常情況下，構建好的文庫可通過長度分布檢測和濃度檢測來進行質量評價。
2. 文庫濃度檢測可使用：基于雙鏈DNA熒光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR絕對定量的方法。
3. 文庫濃度檢測不可使用：基于光譜檢測的方法，如NanoDrop®等。
4. 推薦使用qPCR方法進行文庫濃度檢測：Qubit®、PicoGreen®等基于雙鏈DNA熒光染料的濃度測定方法時，無法有效區分單端連接Adapter的產物、兩端均未連接Adapter的產物以及其他不完整雙鏈結構產物；qPCR絕對定量基于PCR擴增原理，僅定量樣品中兩端Adapter完整的文庫（即可測序的文庫），可排除單端或雙端都不連接Adapter的不可測序文庫的干擾。
5. 文庫長度分布檢測，可通過Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛細管電泳或微控流原理的設備進行檢測。
使用方法
一、自備材料
1. 純化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效產品。
2. DNA質控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效產品。
3. DNA Adapter：可選Yeasen 48種Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)；單端 96種 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612)；雙端384種CDI Primers：Hieff NGS® 384 CDI Primer for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12412~Cat#12413)；雙端384種UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina® (Cat#12404~Cat#12407)。
4. 其他材料：無水乙醇、滅菌超純水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR儀等。
二、操作流程
圖1 Hieff NGS® Ultima Pro DNA Library Prep Kit for Illumina操作流程
三、操作步驟
3.1 末端修復/dA尾添加 (End Repair/dA-Taling)
該步驟將片段化后的Input DNA末端補平，并進行5’端磷酸化和3’端加dA尾。
1. 將表4中各試劑解凍后，顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表4所示反應體系。
表4 末端修復/dA尾添加PCR反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
Fragmented DNA | x |
Endprep Buffer 2.0 | 6 |
Endprep Enzyme 2.0 | 4 |
ddH2O | Up to 60 |
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液離心至管底。
4. 將上述PCR管置于PCR儀，設置表5所示反應程序，進行末端修復/dA尾添加反應。
表5 末端修復/dA尾添加PCR反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105 °C | On |
30 °C | 20 min |
72 °C | 20 min |
4 °C | Hold |
3.2 接頭連接 (Adapter Ligation)
該步驟將3.1步驟的產物末端，連接特定的Illumina®接頭。
1. 根據Input DNA量按表2稀釋Adapter至合適濃度。
2. 將表6中各試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
3. 于3.1步驟PCR管中配制表6所示反應體系。
表6 Adapter Ligation PCR體系
名稱 | 體積 (μL) |
dA-tailed DNA（3.1步驟產物） | 60 |
Ligation Enhancer 2.0 | 30* |
DNA Adapter | 5** |
Rapid T4 DNA Ligase 2.0 | 5 |
【注】：*Ligation Enhancer比較粘稠，請上下顛倒、振蕩，充分混勻并瞬時后離心使用。
**本公司接頭濃度與常規商業化試劑盒一致，皆為15 μM。請根據注意事項三中的提示，對接頭進行稀釋，加水補齊，使接頭體積為5 μL。
4. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
5. 將PCR管置于PCR儀中，設置表7所示反應程序，進行接頭連接反應：
表7 Adapter Ligation PCR反應程序
溫度 | 時間 |
熱蓋105 °C | Off |
20 °C | 15 min |
4 °C | Hold |
【注】：當Input DNA量較低，實驗效果不理想時，可嘗試將連接時間延長一倍。
3.3 連接產物磁珠純化 (Post-Ligation Clean Up)
該步驟使用磁珠對3.2步驟的產物進行直接純化或分選。純化可除去未連接的Adapter或Adapter Dimer等無效產物。直接純化步驟參考3.3.1，分選步驟參考3.3.2。
3.3.1 純化操作步驟：
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡至少30 min。配制80%乙醇。
2. 渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證充分混勻。
3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation產物中，渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫孵育5 min。
4. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
5. 保持PCR管始終置于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec后，小心移除上清。
6. 重復步驟5，總計漂洗兩次。
7. 保持PCR管始終置于磁力架中，開蓋空氣干燥磁珠至剛剛出現龜裂（不超過5 min）。
8. 將PCR管從磁力架中取出，進行洗脫：
1)如產物無需進行片段分選，直接加入21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。【注】：如純化產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。
2)如產物需進行雙輪分選，加入102 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打至充分混勻，室溫靜置5 min。
【注】：如純化產物如需保存，可使用TE Buffer洗脫。將PCR管短暫離心并置于磁力架中靜置，待溶液澄清后（約5 min），小心移取100 μL上清至新PCR管中，切勿觸碰磁珠。
3.3.2 雙輪分選操作步驟：
1. 準備工作：將Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室溫平衡約30 min。配制80%乙醇。
2. 請渦旋振蕩或充分顛倒磁珠以保證混勻。
3. 根據DNA片段長度要求，參考表8向上述100 μL DNA上清中加入第一輪分選磁珠，渦旋或移液器吹打10次混勻。
表8 磁珠文庫分選推薦比例
DNA文庫大小（插入片段） | 150 - 250 bp | 200-300 bp | 300-400 bp | 400-500 bp |
DNA文庫大小 | 250-350 bp | 350-450 bp | 450-550 bp | 550-650 bp |
第一輪體積比 (Beads:DNA) | 0.80× | 0.70× | 0.60× | 0.55× |
第二輪體積比 (Beads:DNA) | 0.20× | 0.20× | 0.20× | 0.15× |
【注】：表中“×"表示樣品DNA體積。如文庫插入片段長度為250 bp，樣品DNA體積為100 μL，則第一輪分選磁珠使用體積為0.70×100 μL=70 μL；第二輪分選磁珠使用體積為0.20×100 μL=20 μL；表中所推薦比例是針對于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用戶在接頭連接前進行分選，請采用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Cat#12601)說明書中推薦的比例。
4. 室溫孵育5 min。
5. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心轉移上清到干凈的離心管中。
6. 參考表8向上清中加入第二輪分選磁珠。
7. 渦旋混勻或移液器吹打10次混勻，室溫靜置5 min。
8. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中，待溶液澄清后（約5 min），小心移除上清。
9. 保持PCR管始終處于磁力架中，加入200 μL新鮮配制的80%乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。
10. 重復步驟9。
11. 保持PCR管始終處于磁力架中，開蓋干燥磁珠至剛剛出現龜裂（約5 min）。
12. 將PCR管從磁力架中取出，加入適量21 μL ddH2O，渦旋振蕩或使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置5 min。
13. 將PCR管短暫離心并置于磁力架中分離磁珠和液體。待溶液澄清后（約5 min），小心轉移20 μL上清至干凈的管中。
3.4 文庫擴增 (Library Amplification)
該步驟將對純化或長度分選后的接頭連接產物進行PCR擴增富集。
1. 將表9中試劑解凍后顛倒混勻，置于冰上備用。
2. 于無菌PCR管中配制表9所示反應體系。
表9 PCR擴增反應體系
名稱 | 體積 (μL) |
Adapter Ligated DNA（3.3步驟產物） | 20 |
Canace® Pro Amplification Mix 2.0 | 25 |
Primer mix | 5 |
【注】：*如果使用的是完整接頭（Cat#12615~ Cat#12618），使用試劑盒中的Primer Mix進行擴增；如果使用了不完整的接頭（Cat#12611~Cat#12612、Cat#12412~Cat#12413、Cat#12404~Cat#12407），請參照上述試劑盒說明書，使用其中配備的Index Primer進行擴增。
3. 使用移液器輕輕吹打或振蕩混勻，并短暫離心將反應液收集至管底。
4. 將PCR管置于PCR儀中，設置表10所示反應程序，進行PCR擴增。
表10 PCR擴增反應程序
溫度 | 時間 | 循環數 |
98 °C | 1 min | 1 |
98 °C | 10 sec | 參照注意事項中表3 |
60 °C | 30 sec | |
72 °C | 30 sec | |
72 °C | 5 min | 1 |
4 °C | Hold | - |
3.5 擴增產物磁珠純化或分選 (Post Amplification Clean Up/Size Selection)
同3.3.1步驟中純化操作步驟。使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)純化文庫擴增產物。
如需分選，操作方法同3.3.2雙輪分選步驟（純化步驟可省略）。
3.6 文庫質量控制
通常情況下，構建好的文庫可通過濃度檢測和長度分布檢測來進行質量評價，具體請參見注意事項六。
