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產(chǎn)品描述

植物組織培養(yǎng)可以依階段區(qū)分為：一、引發(fā)愈傷組織( callus )，因為只有callus可以進行組織培養(yǎng)。 二、從callus誘導(dǎo)成根或芽。組培的方式可以分為3種：1）固體培養(yǎng)，將植物組織放置于固體培養(yǎng)基上，通常培養(yǎng)在玻璃瓶或塑膠瓶內(nèi)。2）平板培養(yǎng)，將植物組織埋于固體培養(yǎng)基中，并且培養(yǎng)在培養(yǎng)皿。3）液體培養(yǎng)，將植物組織培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中，一般來說培養(yǎng)在生物反應(yīng)器內(nèi)，可以再細分為靜止培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和漂浮培養(yǎng)。在整個組織培養(yǎng)的過程，最擔(dān)心的就是微生物的污染，所以用于植物組織培養(yǎng)的抗菌與抗真菌劑是非常必須的。

植物組培抗菌劑（Plant Preservative Mixture, PPM）是一種廣譜抗微生物劑，可以殺死細菌和真菌細胞，防止真菌孢子的萌發(fā)，并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體。研究表明PPM活性成分可以穿透真菌或細菌細胞壁，抑制檸檬酸循環(huán)和電子傳遞鏈等中心代謝循環(huán)中的關(guān)鍵酶的活性，并且可以抑制培養(yǎng)基中的單糖和氨基酸向真菌和細菌細胞的運輸。PPM能有效地抑制植物細胞和植物組織培養(yǎng)中的通過空氣、水、人傳播的微生物污染及內(nèi)源性污染，而不會影響體外種子發(fā)芽、愈傷組織增殖和愈傷組織的再生。

產(chǎn)品優(yōu)點

與普通的抗生素相比，優(yōu)勢體現(xiàn)在：

1）是一種廣譜、高效抗菌/抗真菌劑。

2）比常用抗生素價格更低廉，可以作為植物組織培養(yǎng)基的標(biāo)準(zhǔn)成分，并可作為常規(guī)使用。

3）因為它的靶標(biāo)是抑制多種酶，所以產(chǎn)生抗耐藥性的突變體是不可能的。

4）具有熱穩(wěn)定性，可以和培養(yǎng)基一起滅菌。

運輸與保存方法

冰袋運輸，4℃保存，有效期兩年。

使用方法

以下所述的操作流程是通用的，可能需要根據(jù)待處理的特定物種稍作改動。

1.含有PPM的培養(yǎng)基可以在超凈臺外面分裝，即無需無菌操作，等瓊脂凝固后把蓋子蓋好。如果用泵來分裝培養(yǎng)基，建議在分裝前后先用高壓滅菌處理的熱水清理導(dǎo)管/軟管。

2.如果儲存在無菌容器或在此之前儲備液未受污染，含PPM的熱敏感或熱穩(wěn)定的液體培養(yǎng)基無需經(jīng)微孔濾膜或高壓滅菌處理。但是對于含有200 mg/L或更多氨基酸或蛋白質(zhì)的富集培養(yǎng)基，建議加入PPM后用濾膜過濾處理。

3.超凈工作臺里的器具（鑷子或）無需在火焰上燒，只要定期地在70%酒精里蘸一下即可。超凈工作臺無需驗證，可以在超凈工作臺外面的干凈臺面上操作，不超過一小時即可。

4. PPM溶液呈酸性，pH 3.8，需保存在4℃。低接種密度下推薦工作劑量0.05-0.2%（v/v），可在滅菌前或滅菌后加入培養(yǎng)基，防止通過空氣傳播污染或內(nèi)源性污染。處理內(nèi)源性污染或獲得無農(nóng)桿菌的植物材料需要高劑量的PPM。

5.對于一些常規(guī)情況下表皮上被大量細菌或真菌孢子污染的種子來說，PPM的抗菌效率可能比較弱。對于體外萌發(fā)實驗，種子應(yīng)該按照傳統(tǒng)的方法先用漂白劑進行表面消毒。因此，在含有PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基里，在一個非滅菌的容器中種子可以在自來水下沖洗然后在超凈臺中吹干。如果所使用的器具末端接觸到活性細菌、真菌組織或其它懷疑被污染的東西，這些器具應(yīng)該通過高壓或電子加熱設(shè)備進行滅菌。

6.一般劑量水平：

除了內(nèi)源性污染以外，推薦劑量是0.05-0.2%。對于愈傷增殖、器官形成和胚胎形成，推薦的劑量范圍是0.05-0.075%。低接種密度或者處理緩慢生長的細菌條件下，在培養(yǎng)基滅菌前或滅菌后加入此劑量的PPM，可防止空氣傳播的污染和內(nèi)源性污染。要消除更高密度的內(nèi)源性污染，需要增加PPM的劑量（參考7-內(nèi)源性污染）。

7.內(nèi)源性污染

a）對于外植體：以1cm（或更短）外植體為例，添加4~5% PPM到MS基礎(chǔ)鹽中，但千萬不要添加Tween 20和 pH調(diào)整劑，攪拌4~12小時之后直接拿出。不用清洗，直接插入含有PPM的培養(yǎng)基里，若是草本植物換至0.05~0.1%PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基即可；而木本植物則換至0.2% PPM的萌發(fā)培養(yǎng)基。

注意：以下從第7段（b）到10用于觀賞植物。

b）對于塊莖，球莖和鱗狀物：把整個塊莖/球莖/鱗狀物在漂白劑里搖或攪拌。然后用水沖洗（可以在非無菌條件下操作）。把塊莖/球莖切成小片，在含有4-5%PPM的全基鹽中搖或攪拌12-24 h，不要加pH調(diào)整劑和Tween 20。不用沖洗直接插入到含有0.1-0.2% PPM的培養(yǎng)基中。

8.如果按照以上操作流程沒有取得滿意的結(jié)果（尤其是厚的和非常密集的外植體、種子），我們建議按照以下流程：
a）在水中搖或攪拌外植體（較軟的組織1h，較堅硬的組織2h）；

b）在含有50% PPM的MS基礎(chǔ)鹽中（不加pH調(diào)整劑和Tween 20）搖或攪拌5-10 min。
c）無需沖洗，直接把處植體插入到培養(yǎng)基中。如果真菌污染，可以選擇額外再加入PPM到培養(yǎng)基中。然而，對于細菌或混合污染，第一個月在培養(yǎng)基中加入0.05-0.2%的PPM是必要的。不要丟棄高度氧化的外植體，因為大約50%的外植體在4-6周內(nèi)即可恢復(fù)正常。

9.為了消除“組培中"污染的植物材料（搶救措施）：

注意：僅適合明顯觀察到受污染不超過一周的組織。

a）在自來水細水流下面用牙刷清洗材料。在含有50% PPM（用滅菌水稀釋）中搖或攪拌5-15 min。對于細菌或混合污染，我們建議用低pH值2.8-3.2的溶液，即100% PPM與0.6g/L的檸檬酸溶液（用滅菌水）按1：1混合。

b）不用沖洗直接把處理好的材料插入到含有0.05-0.2% PPM的培養(yǎng)基里，培養(yǎng)至少一個月。天弱光培養(yǎng)，如上所提，不要丟棄高度氧化的外植體，等4-6周以后將約有50%的材料恢復(fù)。

對于真菌孢子或細菌位于外植體極深的部位，而PPM無法接觸到的情況，需要把材料在水中浸泡一段時間，然后沿著外植體切片，在50% PPM中搖或攪拌5-15 min。通過以上消毒步驟，保證PPM能夠充分接觸到外植體的整個表面。

10.去除農(nóng)桿菌：

共培養(yǎng)之后，用水沖洗葉盤。然后把轉(zhuǎn)染的葉盤在含有100% PPM的基礎(chǔ)鹽中蘸（整個葉盤）約2 min。 用兩張無菌紙巾吸干放到含有常用抗生素的培養(yǎng)基上。三周后，轉(zhuǎn)到只含有0.05-0.075% PPM的培養(yǎng)基上。

注意事項

1）采用PPM消毒后轉(zhuǎn)移的材料，我們建議把外植體地插入半固體培養(yǎng)基中。

2）50% PPM溶液能重復(fù)利用大約5-10次。重復(fù)利用的次數(shù)取決于所處理外植體的體積和接種密度。保存50% PPM在4℃以延長它的活性。如有必要，準(zhǔn)備兩種PPM消毒液：一種是滅菌內(nèi)源性污染，第二種是滅菌“組培中"的污染。用第二種消毒溶液處理材料后都要用0.2 μm的濾膜濾滅，濾滅過程可以非無菌條件下完成。一個濾器能用于溶液濾滅的整個過程。

3）如果用50% PPM處理材料效果仍不佳，可以用100% PPM。處理方法跟50% PPM相似，但處理時間不要超過10 min。

4）PPM 的使用為任何一個組織培養(yǎng)實驗室?guī)肀憷O大地提高技術(shù)人員和實驗室的工作效率。但每個實驗室的工作條件不同可能使得PPM效力的發(fā)揮具有一定的波動性。建議工作人員根據(jù)以上步驟操作的前提下，并進行優(yōu)化調(diào)整以確認(rèn)PPM效力發(fā)揮的最佳工作條件，或者確認(rèn)PPM是否能滿足其特定的應(yīng)用要求。整體來說，PPM是能夠非常有效的預(yù)防植物樣本受到的空氣污染，水介質(zhì)污染以及人源接觸帶來的各種污染。使用得當(dāng)，PPM可以拯救內(nèi)源性污染的外植體；推薦劑量（0.05-0.2%（v/v））下PPM幾乎不造成任何負面損傷。

5）為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
6）本產(chǎn)品僅作科研用途！
 

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