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產品簡介
| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 醫療衛生,生物產業 |
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CAR/TCR基因拷貝數檢測試劑盒基于熒光探針定量PCR原理，采用多重qPCR方法分別檢測轉移質粒上與整合或表達功能相關的DNA序列和人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法
產品介紹
產品簡介
CAR/TCR基因拷貝數檢測試劑盒適用于定量檢測來源于HIV-1型慢病毒載體技術制備的人源細胞產品，如CAR-T或TCR-T細胞基因組中CAR或TCR基因的拷貝數。
CAR/TCR基因拷貝數檢測試劑盒基于熒光探針定量PCR原理，采用多重qPCR方法分別檢測轉移質粒上與整合或表達功能相關的DNA序列和人體細胞中單拷貝基因(Single Copy Gene, SCG)的方法，計算得到樣本中平均每個細胞的目的基因拷貝數，如CAR或TCR基因拷貝數水平。其定量限可以達到101 copies/μL水平。該試劑盒需要與本公司的磁珠法殘留DNA樣本前處理試劑盒(Cat#18461ES/18462ES)配套使用。
產品信息
貨號 | 41313ES50 / 41313ES60 |
規格 | 50 T / 100 T |
組分信息
組分編號 | 組分名稱 | 41313ES50 | 41313ES60 |
41313-A | CAR/TCR qPCR Mix | 0.75 mL | 1.5 mL |
41313-B | CAR/TCR Primer&probe Mix | 200 μL | 400 μL |
41313-C | DNA Dilution Buffer | 2×1.8 mL | 4×1.8mL |
41313-D | CAR/TCR DNA Control (2.1×108 copies/μL) | 25 μL | 50 μL |
41313-E | IC* | 50 μL | 100 μL |
*IC：Internal control，內部對照。
運輸和儲存條件
1. 所有組分均干冰運輸，-25~-15℃保存，有效期2年。且41313-A和41313-B均需避光保存。
2. 收到貨后，請檢查共5個組分是否齊全，并立即放入對應的保存溫度中儲存。
適用機型
包含但不限于以下儀器：
Thermo Scientific：ABI 7500，ABI Quant Studio 5；
上海宏石醫療科技：SLAN-96S。
使用說明
CAR/TCR DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備
CAR/TCR DNA定量參考品是同時含有CAR/TCR目的基因序列和SCG目的基因序列的質粒DNA，所以試劑盒的CAR/TCR DNA Control組分里，CAR/TCR和SCG的基因拷貝數是一樣的。
用試劑盒中的DNA Dilution Buffer（DNA稀釋液）將CAR/TCR DNA Control定量參考品進行梯度稀釋*，稀釋濃度依次為2.1×106 copies/μL、2.1×105 copies/μL、2.1×104 copies/μL、2.1×103 copies/μL、2.1×102 copies/μL。操作如下：
1）將試劑盒中CAR/TCR DNA Control和DNA Dilution Buffer置于室溫融化，然后輕微振蕩混勻，低速離心10 sec。
2）取6支干凈的1.5 mL離心管，分別標記為Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5。
3）在標記Std0的1.5 mL管中加90 μL DNA Dilution Buffer和10 μL CAR/TCR DNA Control，即稀釋為2.1×107 copies/μL，振蕩混勻后短暫快速離心10 sec，該濃度可分裝置于-25~-15℃短期保存（不超過6個月）**，使用時避免反復凍融。
4）在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中先分別加入90 μL DNA Dilution Buffer***，再進行梯度稀釋****，稀釋方法如下：
稀釋管 | 稀釋比例 | 終濃度 | |
CAR/TCR (copies/μL) | SCG (copies/μL) | ||
Std1 | 10 μL Std0 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×106 | 2.1×106 |
Std2 | 10 μL Std1 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×105 | 2.1×105 |
Std3 | 10 μL Std2 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×104 | 2.1×104 |
Std4 | 10 μL Std3 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×103 | 2.1×103 |
Std5 | 10 μL Std4 + 90 μL DNA Dilution Buffer | 2.1×102 | 2.1×102 |
表1 標準品梯度稀釋
*每個濃度做3個復孔，該試劑可測試2.1×106 copies/μL~2.1×102 copies/μL線性范圍。若需要，可適當擴大或縮小線性范圍。
**為減少反復凍融次數和避免污染，建議初次使用時將DNA定量參考品分裝儲存于-25~-15℃。
***已融化未使用的DNA Dilution Buffer可保存于2~8℃ 7天，若長時間不用，請放置于-25~-15℃。
****為確保模板混勻，每個梯度稀釋時需輕微震蕩混勻約1 min。
樣本加標回收質控ERC的制備
根據需要設置ERC中CAR/TCR DNA標準品濃度（以制備加2.1×104 copies CAR/TCR DNA量的ERC為例），具體操作：
1） 取100 μL待測樣本加入1.5 mL潔凈的離心管中，再加入10 μL Std4，混勻，標記為ERC。
2） 加標回收ERC和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備加標回收ERC純化液。
陰性抽提質控NCS的制備
根據實驗設置陰性抽提質控NCS，具體操作如下：
1） 取100 μL樣本基質溶液（或DNA Dilution Buffer）加入1.5 mL潔凈的離心管中，標記為NCS。
2） 陰性質控NCS和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質控NCS純化液。
無模板對照NTC的制備
根據實驗設置無模板對照NTC，具體操作如下：
1） 無模板對照NTC無需進行樣本前處理，在qPCR法檢測CAR/TCR DNA含量階段開始配置即可。
2） 每管或孔中的NTC反應體系為20 μL Mix混合液（即15 μL CAR/TCR qPCR Mix + 4μL CAR/TCR Primer&Probe Mix+ 1μL IC）+ 10 μL DNA Dilution Buffer，建議配置3個重復孔的量。
反應體系
反應體系 | 體系（μL） |
CAR/TCR qPCR Mix* | 15 |
CAR/TCR Primer&probe Mix | 4 |
IC | 1 |
DNA template** | 10 |
總體積*** | 30 |
表2 標準品反應體系
*根據反應孔數計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液=（反應孔數+2）×(15+4+1) μL（含有2孔的損失量）。通常，每個樣本做3個重復孔。
**反應孔數=（5個濃度梯度的標準曲線+1個無模板對照NTC+1個陰性抽提質控NCS+待測樣TS個數+待測樣本對應加標回收ERC個數）×3。
NTC (No Template Control)：DNA Dilution Buffer
NCS (Negative Control Solution)：樣本基質溶液或DNA Dilution Buffer進行樣本前處理后，所得純化液為NCS
TS (Test Sample)：待測樣本
ERC (Extraction Recovery Control)：待測樣本中加入如2.1×104 copies標準品DNA后進行樣本前處理，所得純化液為加標回收ERC
***加樣完成密封好管子后，請低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。
下圖為參考板位：
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
A | NTC | 待測樣本TS1 | 待測樣本TS1 | 待測樣本TS1 | 標準曲線Std1 | 標準曲線Std1 | 標準曲線Std1 | |||||
B | NTC | 待測樣本TS2 | 待測樣本TS2 | 待測樣本TS2 | 標準曲線Std2 | 標準曲線Std2 | 標準曲線Std2 | |||||
C | NTC | 待測樣本TS3 | 待測樣本TS3 | 待測樣本TS3 | 標準曲線Std3 | 標準曲線Std3 | 標準曲線Std3 | |||||
D | 標準曲線Std4 | 標準曲線Std4 | 標準曲線Std4 | |||||||||
E | NCS | 樣本加標ERC1 | 樣本加標ERC1 | 樣本加標ERC1 | 標準曲線Std5 | 標準曲線Std5 | 標準曲線Std5 | |||||
F | NCS | 樣本加標ERC2 | 樣本加標ERC2 | 樣本加標ERC2 | ||||||||
G | NCS | 樣本加標ERC3 | 樣本加標ERC3 | 樣本加標ERC3 | ||||||||
H |
表3 上機參考板位
該示例是對CAR/TCR基因拷貝數的qPCR法檢測操作的展示，檢測樣本包括：5個濃度梯度的CAR/TCR DNA標準曲線、1個無模板對照NTC、1個陰性質控NCS、3個待測樣本TS、3個樣本加標回收ERC。建議每個樣本做3個重復孔。
擴增程序參數設置（兩步法）（以ABI公司7500 qPCR儀、軟件版本2.0為例）
1）創建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板。
2）創建2個檢測探針，第一個命名為“CAR/TCR-DNA"，選擇報告熒光基團為“FAM"，猝滅熒光基團為“None"；第二個命名為“SCG，選擇報告熒光基團為“VIC"，猝滅熒光基團為“None"；再創建1個檢測探針，命名為“IC"，選擇報告熒光基團為“CY5"，猝滅熒光基團為“None"。參比熒光為ROX"（參比熒光可根據儀器型號等情況，選擇是否需要添加；若選擇ROX校準，建議閾值線選擇0.06）。
3）在“Assign target (s) to the selected wells"面板中，將標準曲線孔的“Task"一欄設置為“Standard"，并且在“Quantity"一欄分別賦值為“2100000"、“210000"、“21000"、“2100"、“210"（含義為每孔的DNA濃度，單位為copies/μL），并且在相應的“sample name"一欄中命名為“2100000 copies/μL"、“210000 copies/μL"、“21000 copies/μL"、“2100 copies/μL"、“210 copies/μL"；將無模板對照NTC孔的“Task"一欄設置為“NTC"；將陰性質控NCS孔、待測樣本TS孔、樣本加標回收ERC孔“Task"一欄設置為“Unknown"，并且在相應的“Sample Name"一欄中分別命名為“NCS"、“TS"、“ERC"，之后點擊“Start Run"，開始儀器運行。
4）擴增程序設置：設置反應體積30 μL。
循環步驟 | 溫度（℃） | 時間 | 循環數 |
污染消化 | 37℃ | 5 min | 1 |
預變性 | 95℃ | 5 min | 1 |
變性 | 95℃ | 15 sec | 45 |
退火/延伸（收集熒光） | 60℃ | 30 sec |
表4 擴增程序
qPCR 結果分析
1）在“Analysis"的“Amplification Plot"面板中，系統會自動給出“Threshold"，有時系統給出的“Threshold"離基線太近，導致復孔之間Ct相差甚遠，可手動調節“Threshold"至合適位置，點擊“Analyze"。此時可在“Multicomponent Plot"初步查看擴增曲線的形態是否正常。
2）在“Analysis"的“Standard Curve"面板中，可讀取標準曲線的R2、擴增效率(Eff%)、斜率(Slope)、截距(Intercept)等。正常的標曲：R2>0.99，擴增效率在90%≤Eff%≤110%范圍內，Slope在-3.6~-3.1。
3）在“Analysis"的“View well table"面板中，“Quantity"一欄可讀取無模板對照NTC、陰性質控NCS、待測樣本TS、樣本加標回收ERC的檢測值，單位為copies/μL，后續可在檢測報告中進行單位換算。
4）結果分析的參數設置需依據具體的機型及使用的軟件版本，一般也可由儀器自動判讀。
5）根據待測樣本TS和樣本加標回收ERC的檢測結果計算加標回收率，加標回收率要求在50%~150%之間。加標回收率計算公式：回收率(%) = {樣本加標測定值(eg.copies/µL)-樣本測定值(eg.copies/µL)} x洗脫體積(µL) / DNA加入量理論值(eg.copies) x 100%。
6）陰性質控NCS的Ct值應為Undetermined或Ct值≥35。
7）無模板對照NTC的檢測結果應為Undetermined或Ct值≥38。
8）每個細胞中的CAR或TCR拷貝數=
注意事項
1. 使用本試劑前請仔細閱讀本說明書，實驗應規范操作，包括樣本處理、反應體系的配制及加樣。
2. 每個組分在使用前都應充分震蕩混勻，低速離心。
3. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
4. 本產品僅作科研用途。
