基因組測序中的“暗區(qū)"和未知區(qū)域問題

由于各種原因，所有基因組都包含“難以測序"的區(qū)域：

·測序深度不足

·繪圖質(zhì)量差

·分階段

·病毒、轉(zhuǎn)基因和 CRISPR 編輯的未知整合位點(diǎn)

長基因測序的必要性

基因組編輯在研究、醫(yī)療保健和農(nóng)業(yè)方面有著強(qiáng)大的應(yīng)用。然而，基因組編輯可能導(dǎo)致的各種分子反應(yīng)事件的范圍被低估了，而且該技術(shù)在目標(biāo)位點(diǎn)內(nèi)外仍然無法預(yù)測。這對于為治療性基因編輯、農(nóng)業(yè)和其他應(yīng)用提供安全方法具有相當(dāng)大的影響。預(yù)測和驗(yàn)證基因組編輯的結(jié)果對于所有應(yīng)用的成功至關(guān)重要。

Cas9 誘導(dǎo)的雙鏈斷裂導(dǎo)致一系列預(yù)期和意外的結(jié)果。 zui 終的編輯結(jié)果導(dǎo)致小的 insert、刪除或染色體易位或不完整的模板整合。

通過各種努力，我們已經(jīng)采用了多種方法來驗(yàn)證正確的基因編輯并確保未發(fā)生針對目標(biāo)的意外編輯事件。 zui 常用的分子方法是通過 Sanger直接DNA 測序或 PCR擴(kuò)增子的 NGS ，其大小通常小于 1000 bp。

其他常見方法包括 T7核酸內(nèi)切酶1 (T7E1) 錯配檢測分析、通過分解跟蹤 insert 缺失 (TIDE) 分析和通過擴(kuò)增子分析 (IDAA) 檢測 insert 缺失、clone PCR 擴(kuò)增子然后測序，但偶爾也包括全基因組測序(WGS)、陣列比較基因組雜交 (CGH)、Southern 印跡、Fiber-FISH 和 FISH。

大多數(shù)情況下，這些方法僅提供有關(guān)基因編輯位點(diǎn)周圍有限區(qū)域的信息，不會捕獲來自 CRISPR/Cas誘變效應(yīng)的整個序列，尤其是不會檢測更大的缺失。為此Kosicki 等人在Nat. Biotechnol上發(fā)表的《Repair of double-strand breaks induced by CRISPR–Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements》論文，強(qiáng)調(diào)了將分子分析擴(kuò)展到包括 CRISPR-Cas9 誘導(dǎo)的 DSB 位點(diǎn)周圍的幾千堿基的重要性，并展示了長讀長測序如何可以高分辨率的分析基因編輯的準(zhǔn)確性。

長讀長測序可以解決許多這些挑戰(zhàn)，但在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室分析中大規(guī)模應(yīng)用不切實(shí)際且成本高昂。

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Samplix 的 Xdrop™ 儀器可以捕獲基因組 DNA 的長 (>100 kb) 區(qū)域。 使用 Xdrop 為科學(xué)家提供了目標(biāo)富集的經(jīng)證實(shí)的好處（減少時間、成本和數(shù)據(jù)分析），與已建立的目標(biāo)富集方法相比具有額外的優(yōu)勢：

解鎖基因組的任何部分

·以僅 100-200 bp 的序列信息為目標(biāo)的任何區(qū)域

快速適應(yīng)新目標(biāo)

·識別和捕獲新目標(biāo)，在 4-5 天內(nèi)準(zhǔn)備好進(jìn)行測序

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·測序能力集中在您感興趣的區(qū)域

減少測序偽影

·使用無 PCR、無偏差的目標(biāo)擴(kuò)增方法

Samplix Xdrop™用于富集長基因組DNA 片段，以通過長讀長和短讀長測序分析 CRISPR-Cas9 編輯細(xì)胞中的基因型和等位基因狀態(tài) 。在論文《Verification of CRISPR editing and finding transgenic inserts by Xdrop Indirect sequence capture followed by short- and long- read sequencing》中，研究人員通過Xdrop技術(shù)在一組 CRISPR 修飾的誘導(dǎo)多能干 (iPS) 細(xì)胞系中檢測到 CRISPR-Cas9 誘導(dǎo)的意外基因編輯。 盡管使用其他幾種互補(bǔ)方法進(jìn)行了全面分析，但早期驗(yàn)證 CRISPR 編輯的嘗試并未檢測到這些意外編輯。

在這項研究中，他們還證明用于評估 CRISPR-Cas9 基因組編輯事件的基于 PCR 的標(biāo)準(zhǔn)程序無法提供足夠準(zhǔn)確的驗(yàn)證。CRISPR 編輯的驗(yàn)證應(yīng)基于對更大區(qū)域的檢查。

Xdrop方法所檢測序列的位置可能與主要感興趣區(qū)域（如基因編輯位點(diǎn)）相距 5-10 千堿基 (kb) 或更遠(yuǎn)。

其實(shí)驗(yàn)過程是在將高分子量 (HMW) DNA 、PCR 試劑和引物分配到雙乳液液滴內(nèi)并進(jìn)行反應(yīng)后，含有目標(biāo) DNA 的液滴通過液滴 PCR識別，然后用 DNA 嵌入熒光染料進(jìn)行染色。

只有含有來自感興趣區(qū)域 (ROI) 的 DNA 的液滴才會產(chǎn)生檢測序列擴(kuò)增子并發(fā)出熒光。由于雙乳液液滴的大小和組成，這些可以在標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞儀細(xì)胞的分選儀器上進(jìn)行分類，以富集熒光液滴。

然后分離含有長 DNA 片段的液滴，并通過液滴中的單分子多重置換擴(kuò)增(dMDA) 進(jìn)行擴(kuò)增。dMDA 的擴(kuò)增能力能夠從 6 pg 的輸入 DNA 中產(chǎn)生約 1.5 μg 的擴(kuò)增 DNA，并且對大于 5 kb 的分子 zui 有效。由此產(chǎn)生的富集 DNA 與短讀長和長讀長測序平臺兼容。

Xdrop間接序列捕獲方法可采用距基因編輯位點(diǎn) 5–10 kb 或更遠(yuǎn)的距離設(shè)計的引物，它在高深度測序提供了大約 100 kb 長的區(qū)域的序列讀取覆蓋。這允許對基因編輯站點(diǎn)周圍區(qū)域中潛在的意外編輯進(jìn)行完整調(diào)查。Xdrop技術(shù)展示了如何在事先不了解其基因組整合的情況下也能夠識別轉(zhuǎn)基因 insert 位點(diǎn)。

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