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兔(Rabbit)腫瘤壞死因子a(TNF-a)檢測試劑盒

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兔(Rabbit)腫瘤壞死因子a(TNF-a)檢測試劑盒

用 途

兔TNF-α ELISA試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、緩沖液中細(xì)胞上清液及各種體液中的TNF-α 。本試劑盒可以檢測天然和重組的TNF-α 。本試劑盒于科研、而非用于臨床診斷。

試驗原理

兔TNF-α 試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA).已知TNF-α 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將TNF-α 和生物素標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除未結(jié)合的酶結(jié)合物,然后加入底物A、B,和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中TNF-α 的濃度呈比例關(guān)系。

試劑盒內(nèi)容及其配制

試劑盒成份(2-8℃保存)

96孔配置

48孔配置

配制

96/48人份酶標(biāo)板

1塊板(96T)

半塊板(48T)

即用型

塑料膜板蓋

1塊

半塊

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品:400pg/ml

1瓶(0.6ml)

1瓶(0.3ml)

按說明書進(jìn)行稀稀

空白對照

1瓶(1.0ml)

1瓶(0.5ml)

即用型

標(biāo)準(zhǔn)品稀釋緩沖液

1瓶(5ml

1瓶(2.5ml

即用型

生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體

1瓶(6ml

1瓶(3.0ml

即用型

親和鏈酶素-HRP

1瓶(10ml)

1瓶(5.0ml)

即用型

洗滌緩沖液

1瓶(60ml)

1瓶(30ml)

按說明書進(jìn)行稀釋

底物A

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

即用型

底物B

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

即用型

終止液

1瓶(6.0ml)

1瓶(3.0ml)

即用型

自備材料

  1. 蒸餾水。
  2. 加樣器:5ul、10 ul、50 ul、100 ul、200、500 u、1000lul。
  3. 振蕩器及磁力攪拌器等。 

安全性

  1. 避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體,請盡快用水沖洗。
  2. 實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。
  3. 不要用嘴吸取試劑盒里的任何成份。 

操作注意事項

  1. 試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存,使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄,不可保存。
  2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中,密封保存,以免變質(zhì)。
  3. 不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。
  4. 使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。
  5. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。
  6. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。
  7. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。
  8. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。
  9. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。 

樣品收集、處理及保存方法

  1. 血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后,1000×g離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
  2. 血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。
  3. 細(xì)胞上清液---1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
  4. 保存------如果樣品不立即使用,應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存,避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒,檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 

試劑的準(zhǔn)備

  1. 標(biāo)準(zhǔn)品:標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實驗時準(zhǔn)備,不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行:

400 pg/ml

(6號標(biāo)準(zhǔn)品)

原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

200 pg/ml

(5號標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

100 pg/ml

(4號標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50 pg/ml

(3號標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25 pg/ml

(2號標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

12.5 pg/ml

(1號標(biāo)準(zhǔn)品)

100ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入100ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0 pg/ml

(空白對照)

原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

  1. 洗滌緩沖液(20×)的稀釋:蒸餾水20倍稀釋。 

操作步驟

  1. 使用前,將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫,以免加樣時加入大量的氣泡,產(chǎn)生加樣上的誤差。
  2. 根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定,能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。
  3. 加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板,輕輕振蕩混勻,37℃溫育1小時。
  4. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
  5. 每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP,輕輕振蕩混勻,37℃溫育30分鐘。
  6. 甩去孔內(nèi)液體,每孔加滿洗滌液,振蕩30秒,甩去洗滌液,用吸水紙拍干。重復(fù)此操作3次。如果用洗板機洗滌,洗滌次數(shù)增加一次。
  7. 每孔加入底物A、B各50ul,輕輕振蕩混勻,37℃溫育10分鐘。避免光照。
  8. 取出酶標(biāo)板,迅速加入50ul終止液,加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。
  9. 在450nm波長處測定各孔的OD值。 

建議使用的實驗方案

 

標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/ml)

 

A

400

400

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

B

200

200

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

C

100

100

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

D

50

50

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

E

25

25

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

F

12.5

12.5

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

G

0

0

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

H

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

樣品

結(jié)果分析

以吸光度OD值為縱坐標(biāo)(Y),相應(yīng)的TNF-α 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(X),做得相應(yīng)的曲線,樣品的TNF-α 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

局限

6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的,根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

  1. 靈敏度:zui小的檢測濃度小于1號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。
  2. 特異性:不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。
  3. 重復(fù)性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于10%。

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