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細胞總乙酰化水平的快速測定方法
細胞總乙酰化水平的快速測定方法
-------免疫親和色譜-ELISA 方法
步驟一:親和色譜分離提純乙酰化蛋白
1. 用細胞裂解液裂解細胞,10000rpm 離心2 分鐘,取上清備用。
2. 取20-40ul 抗乙酰化賴氨酸抗體填料(Anti-acetylated lysine Agarose,ICP0388,如右圖所示),
用PBS 洗2 次,每次1ml。
3. 將細胞裂解上清液與洗好的填料(ICP0388)混勻,39oC 旋轉搖床低速孵育60 分鐘。
4. 1000rpm 離心1 分鐘,去上清,用PBSt 重懸沉淀,1000rpm 離心1 分鐘,去上清,重復3 次,
zui后一次用PBS 洗,吸棄上清。
注:細胞裂解液里應該含有蛋白酶抑制劑,組蛋白乙酰化酶抑制劑等。
步驟二:釋放及包被固定分離提純的乙酰化蛋白
5. 用20ul 0.1M HCL 將步驟2 的抗賴氨酸抗體填料-乙酰化蛋白復合物于沸水中煮2 分鐘,10000rpm
離心1 分鐘,將上清液體全部轉移到含有80ul 的0.2M Na2CO3 的ELISA 薄板上,39oC 孵育30 分鐘;
6. 取出ELISA 薄板,拍干。用PBSt 清洗2 次,每次均需拍干。加入100ul 含0.5%BSA 的PBSt ,39oC
封閉10 分鐘。
步驟三:用抗乙酰賴氨酸抗體HRP 標記物檢測蛋白乙酰化水平
7. 取出ELISA 薄板,拍干,用PBSt 清洗2 次,拍干。加入100ul 濃度為0.25ug/ml 抗賴氨酸抗體
HRP 偶聯復合物(Anti-acetylated lysine HRP conugates,ICP0381,如右圖所示),39oC 孵育30 分鐘。
8. 取出ELISA 薄板,拍干,用PBSt 清洗板孔3 次,每次均需拍干。加入100ul TMB 液,39oC 孵育顯色
10-20 分鐘。zui后加入100ul 0.1 M H2SO4 終止反應,在450nm 波長下讀數。
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