免疫組化操作規程

（一）、儀器設備
   1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；
    2）水浴鍋

（二）、試劑 
    1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
    2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
    3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
    4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris堿，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。 
    5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
    6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
    7）封裱劑：
    a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合； 
    b、油和TBS(或PBS)配制。  
    8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用于熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合于光學顯微鏡標本。

（三）、操作流程 
    1、脫蠟和水化 
    脫蠟前，應將組織芯片在室溫中放置60分鐘或60℃恒溫箱中烘烤20分鐘。 
    1）組織芯片置于二甲苯中浸泡10分鐘，更換二甲苯后再浸泡10分鐘；
    2）無水乙醇中浸泡5分鐘；
    3）95%乙醇中浸泡5分鐘； 
    4）70%乙醇中浸泡5分鐘； 
    2、抗原修復
   用于福爾馬林固定的石蠟包埋組織芯片。
   1）抗原熱修復
   （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置于金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鐘，然后將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鐘后，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去后打開蓋子。本方法適用于較難檢測或核抗原的抗原修復。
   （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織芯片加熱10~15分鐘。
   （3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰后將組織芯片放入，斷電，間隔5~10分鐘，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。 
   2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鐘；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鐘。適用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
    3、免疫組織化學染色 
    SP法
    1）脫蠟、水化；
    2）PBS洗2～3次各5分鐘；
    3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鐘；
    4）PBS洗2～3次各5分鐘； 
    5）抗原修復；
    6）PBS洗2～3次各5分鐘；
    7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體。
    8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過或者37℃1小時。
    9）4℃夜后需在37℃復溫45分鐘。
    10）PBS洗3次各5分鐘；
    11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
    12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
    13）PBS洗3次各5分鐘；
    14）DAB顯色5～10分鐘，在顯微鏡下掌握染色程度；
    15）PBS或自來水沖洗10分鐘；
    16）蘇木精復染2分鐘，鹽酸酒精分化；
    17）自來水沖洗10～15分鐘；
    18）脫水、透明、封片、鏡檢。 
    SABC法
    1)脫蠟、水化。
    2)PBS洗兩次各5分鐘。
    3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鐘，蒸餾水洗3次。
    4)抗原修復。
    5)PBS洗5分鐘。
    6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鐘。甩去多余液體。
    7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃夜或者37℃1小時（4℃夜后在37℃復溫45分鐘）。
    8)PBS洗三次每次2分鐘。
    9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鐘。
    10)PBC洗3次每次2分鐘。
    11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鐘。
    12)PBS洗4次每次5分鐘。
    13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
    14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鐘、鹽酸酒精分化。 
    15)脫水、透明、封片、鏡檢。