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參考價	面議

細胞分析

檢測試劑盒

細胞凋亡

細胞增殖

細胞活性

ROS檢測

細胞代謝

細胞自噬

細胞成像

細胞粘附

細胞pH檢測

細胞耗氧與酸化

細胞示蹤與追蹤

離子指示劑及膜電位

貝博生物

供貨周期	一周	應用領域	生物產(chǎn)業(yè)

細胞凋亡是細胞的基本特征之一，它在機體的胚胎發(fā)育、組織修復、內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定和一些疾病發(fā)生過程等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂酰（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂酰（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。在體內(nèi)，巨噬細胞可以識別翻轉(zhuǎn)到細胞膜表面的PS 從而將這些程序性死亡的細胞清除，因此凋亡過程中并不伴隨局部的炎癥反應，而在細胞壞死的過程中則常常伴隨著炎癥反應。

詳細介紹

保存溫度

2-8℃避光

Annexin V-Cy5 細胞凋亡檢測試劑盒注意事項

1.長期不用可以-20℃保存。
2.Annexin V-Cy5染色液避免反復凍融。多次凍融會導致失效。
3.Annexin V-Cy5染色液需要長期保存時可以根據(jù)使用情況進行小量分裝后-20℃保存。
4.試劑拆封后請盡快使用完！

有效期

1年

1.檢測方法

2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

適用樣本

1.懸浮細胞
2.貼壁細胞

產(chǎn)品特點

1.方便：可用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測；
2.快速：1小時內(nèi)即可完成實驗；
3.準確：能準確區(qū)分活細胞、凋亡細胞和壞死細胞，并計數(shù)各群細胞的比例。

產(chǎn)品應用

1.流式細胞儀
2.激光共聚焦
3.熒光顯微鏡

儀器準備

1.流式細胞儀或熒光顯微鏡或激光共聚焦
2.離心機
3.移液器
4.冰箱
5.冰盒

試劑準備

1.PBS 緩沖液（pH7.4，實驗室常用的10mM磷酸緩沖鹽溶液（1X））
2.或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

耗材準備

1.離心管
2.吸頭
3.一次性手套
4.鋁箔

Annexin V-Cy5 細胞凋亡檢測試劑盒使用注意事項

1.螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體收集至管底，避免開蓋時液體損失導致試劑量不夠用。
2.細胞處理需要小心操作,盡量避免人為的損傷細胞。離心力在不損失細胞的前提下盡可能小，重懸細胞是動作要輕柔，避免多次反復的激烈吹打。不用渦旋振蕩器。
3.Annexin V-FITC（等）和Propidium iodide（等）是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光，盡量減少它們暴露在光下的時間。有必要時可以使用帶蓋子的冰盒或鋁箔紙避光。標記后將細胞保持在避光環(huán)境中。移液過程中短暫暴露在光線下（<30秒）是可以接受的。
4.由于細胞凋亡是一個快速和動態(tài)的過程，因此在染色后立即進行分析。
5.使用Annexin V-FITC（等）試劑盒檢測凋亡需要針對活細胞。不要固定細胞，固定操作會對結(jié)果產(chǎn)生干擾。

使用方法

樣品染色：
1. 離心收集懸浮細胞。離心機300-500g力，2-8°C，離心時間5分鐘，棄培養(yǎng)基。（貼壁細胞用不含EDTA的消化后離心，收集細胞。消化時間不宜過長，以防損傷細胞膜，引起假陽性）。
2. 用冷PBS洗滌細胞兩次。
3. 用400ul 1X Annexin V結(jié)合液懸浮細胞，濃度大約為1 X 106 cells/ml。
4. 在細胞懸浮液中加入5ul Annexin V- Cy5染色液，輕輕混勻后于2-8°C避光條件下孵育15分鐘。
5. 加入其它顏色的核酸染色液后輕輕混勻于2-8°C避光條件下孵育5分鐘。
6. 立即用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

流式細胞儀分析：
上機檢測前，須用待測細胞制備三個質(zhì)控樣本來設定流式細胞儀的熒光補償和設置十字門的范圍：
① 空白管，沒有染色的細胞：不加Annexin V- Cy5。用于調(diào)節(jié)電壓。
② 單染管，Annexin V- Cy5單染細胞：用明顯凋亡的細胞，僅用Annexin V- Cy5染色細胞。用于調(diào)節(jié)補償。
③ 單染管，7-AAD/PI/其它單染細胞：僅用核酸染料染色細胞。用于調(diào)節(jié)補償。
④ 檢測管：待測的處理細胞，加Annexin V- Cy5，加核酸染料。用空白管和單染管調(diào)節(jié)好電壓補償后，獲得所需要的流式數(shù)據(jù)。
【注】：
具體流式設置按常規(guī)方法即可。請參照流式細胞儀說明書或咨詢儀器技術支持。
經(jīng)處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。
按照常規(guī)的流式凋亡檢測的操作即可。
Annexin V-Cy5的熒光激發(fā)波長652nm，發(fā)射波長670nm；

熒光顯微鏡/激光共聚焦觀察：
1. 滴加30-50ul用Annexin V-Cy5染色的細胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細胞。
注：對于貼壁細胞，可以象懸浮細胞那樣染色后，滴一滴細胞懸液于載玻片上，用蓋玻片蓋上細胞，熒光顯微鏡下觀察。也可直接用蓋玻片培養(yǎng)細胞并誘導細胞凋亡。根據(jù)蓋玻片大小，置于24孔或12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)，然后誘導細胞凋亡。細胞染色在細胞培養(yǎng)板內(nèi)進行。先用PBS沖洗兩次，加入400μl Annexin V結(jié)合液于孔中。再加入5μl Annexin V-Cy5染色液，混勻。避光室溫反應10分鐘。
2. 在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。

Annexin V-Cy5染色陽性的細胞將在細胞膜表面呈現(xiàn)明亮的紅色。其它非滲透核酸染料在早期凋亡細胞不會被染色或顯示背景熒光，而壞死或晚期凋亡細胞則會顯示顏色，相應顏色的胞核和環(huán)繞細胞的紅色胞膜。在晚期凋亡細胞中還可以觀察到胞膜皺縮和起泡。

常見問題分析

實驗過程中Annexin V染不上色或陽性率偏低。可能的原因如下：
1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調(diào)整使用正確的儀器設置。
2. 確定實驗中的誘導劑是否能產(chǎn)生凋亡。可通過設定確切凋亡誘導效果的陽性藥物對照來排除這一情況。
3. 細胞未啟動凋亡。重新確定誘導后凋亡啟動的時間點（時程實驗）。
4. 細胞數(shù)量偏少。增加細胞數(shù)量。
5. 貼壁細胞消化不當。Annexin V 跟PS 的結(jié)合需要Ca2+離子，結(jié)合液中含有Ca2+，EDTA 的消化會影響染色，建議使用無EDTA 的，或者消化后用PBS洗滌干凈。

實驗過程中陽性率偏高。可能的原因如下：
1. 用于檢測的流式細胞儀/顯微鏡設置不當。調(diào)整使用正確的儀器設置。
2. 細胞本身活力太差。實驗中發(fā)現(xiàn)未經(jīng)誘導凋亡的對照細胞經(jīng)染色后AnnexinV+/PI+雙陽性的細胞比例過高，造成這種結(jié)果的原因可能是細胞本身活力太差。建議用臺盼藍染色計算細胞的活力，臺盼藍拒染的細胞應大于95%。若活力偏低低，建議重新復蘇細胞，通常剛復蘇的細胞至少要傳代3 次以后才能進行實驗。

參考文獻

1.Wei Bing, Hanjun Sun et al.
Programmed Bacteria Death Induced by Carbon Dots with Different Surface Charge
Small 2016 （IF=8.315）

2.Linchong Sun, Libing Song et al.
cMyc-mediated activation of serine biosynthesis pathway is critical for cancer progression under nutrient deprivation conditions
Cell Research 2015 （IF=14.812）

3. Jian Chen, Weijie Zhang et al.
Mn(II) mediated degradation of artemisinin based on Fe3O4@MnSiO3-FA nanospheres for cancer therapy in vivo
Nanoscale 2015 （IF=7.76）

4. Yuanxin Zhang, Zhiyao Hou et al.
DNA-Hybrid-Gated Photothermal Mesoporous Silica Nanoparticles for NIR-Responsive and Aptamer-Targeted Drug Delivery
ACS Appl. Mater. Interfaces 2015 （IF=7.145）

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