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2-8℃

避免冷凍。

一年

1.離心機
2.振蕩器
3.渦旋混勻器
4.移液器
5.冰箱
6.冰盒

1.純水

1.離心管
2.吸頭

1.樣品中不能含有β-巰基乙醇、DTT和EDTA、EGTA等。
2.整個純化過程中切忌凝膠脫水變干。
3.為提高純化效率，首先確定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的使用濃度。必要時可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度，Binding Buffer的范圍為0-10 mM，洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來進行。并通過SDS-PAGE或Western Blotting來檢測目的蛋白的純度。
4.請使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過0.22 μm或者0.45 μm過濾器過濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進行離心，或者使用0.22 μm或者0.45 μm過濾器過濾。
5.柱再生時，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

填料參數：
填料體積： 10 ml
動態吸附量： 20 mg 6×His 標簽蛋白（27 kD）/ml 介質
球形基質： 4 %交聯度瓊脂糖
平均粒徑： 90 μm （45‐165 μm）
儲存溶劑： 1× PBS（含20%乙醇）

天然條件下純化多聚標簽蛋白
緩沖液配制
用于配制緩沖液的水和化學試劑必須是高純度的，并建議使用前用0.45 μm 濾膜過濾一遍。
平衡緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用NaOH 調pH 為8.0
洗滌緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用NaOH 調pH 為8.0
洗脫緩沖液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用NaOH 調pH 為8.0

組裝層析柱
1． 將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開，讓乙醇通過重力作用緩慢流出。
2． 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的Binding Buffer平衡柱子，平衡結束后即可上樣。

可溶性蛋白的純化
以下以可溶性蛋白純化為例，使用時以實際樣本為準。

1． 收集菌體后，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 ml細菌裂解液（每1 ml 細菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物），超聲裂解菌體。
2． 10000 rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白。
3． 用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負載上柱，流速為10倍柱體積/小時，收集流穿液。
4． 使用15倍柱體積的Binding Buffer沖洗柱子，洗去雜蛋白。
5． 使用適量Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。
6． 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒），封柱后2-8℃保存。

柱再生
當填料使用多次后，結合效率會有所下降（表現為流速變慢或填料失去藍綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質的結合效率。
1． 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后，使用3倍柱體積的去離子水沖洗。
2． 使用1倍柱體積的2% SDS沖洗。
3． 依次使用1倍柱體積的25%、50%、75%和5倍柱體積的99%乙醇沖洗，再依次使用1倍柱體積的75%、50%和25%的乙醇沖洗。
4． 使用1倍柱體積的去離子水沖洗。
5． 使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液（PH8.0）沖洗。
6． 使用3倍柱體積去離子水，3倍柱體積20%乙醇沖洗。
7． 置2-8°C保存。
8． 再次使用前，需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5個柱體積的50 mM NiSO4再生，3個柱體積的Binding Buffer平衡。
9． 為了長時間的保存，介質應當2‐8 ℃保存在1× PBS（含20 % 乙醇）中。

His標簽蛋白純化過程，經常出現的問題包括幾個方面：
1、 純化的組分中沒有His標簽的蛋白?
2、 HIS標簽蛋白洗脫后雜帶較多?
我們可以根據檢測上柱前蛋白，流穿液蛋白，和洗脫液蛋白的檢測，來進行基本的判斷。是否包涵體蛋白？是否標簽沒有表達出來：可能是因為折疊構象不正確導致標簽在重折疊時沒有位于蛋白質分子的表面上無法與離子柱結合；或者標簽在折疊時沒有位于蛋白質分子的表面上；蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意緩沖液體的pH，此外在樣品中添加一些表面活性劑甚至乙醇等有機溶劑可以增加疏水性蛋白的溶解度，對于帶半多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM巰基乙醇避免沉淀。