T4 DNA Ligase催化雙鏈DNA或RNA中毗鄰的5'-磷酸基團(tuán)和3'-羥基末端之間形成磷酸二酯鍵。酶還可以修復(fù)雙鏈DNA、RNA或DNA/RNA復(fù)合體中的單鏈切口，連接DNA的粘性和平末端，但是該酶對單鏈核酸無酶活性。
T4 DNA Ligase需要輔因子ATP。
特點
- 快速–室溫下10分鐘內(nèi)完成粘末端的連接反應(yīng)。
- 該酶在Thermo Scientific限制性內(nèi)切酶、PCR和RT緩沖液(添加ATP)中有活性。
- 配套提供聚乙二醇溶液，以高效進(jìn)行平末端連接。
應(yīng)用
- 克隆酶切產(chǎn)生的DNA片段。
- 克隆PCR產(chǎn)物。
- 連接雙鏈寡聚核苷酸街頭或連接物。
- 定點誘變。
- 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性 (AFLP)。
- 連接酶介導(dǎo)的 RNA 檢測。
- 雙鏈DNA，RNA 或 DNA/RNA 復(fù)合體中缺口的修復(fù)。
- 線性DNA自身環(huán)化。
濃度
1 Weiss u/µl = 200 CEU*/µl
5 Weiss u/µl = 1000 CEU*/µl
30 Weiss u/µl = 6000 CEU*/µl
* 一個粘性末端連接單位的是指在16°C 、30分鐘內(nèi)50%連接HindIII酶切的lamda DNA產(chǎn)物所需要的酶的量。
來源
含有T4噬菌體克隆基因30的大腸桿菌。
分子量
55.3 kDa，單體。
活性單位定義
1個活性單位是指在ATP-PPi交換反應(yīng)中，37°C、20分鐘內(nèi)將1nmol [
32PPi]轉(zhuǎn)換為Norit可吸收形式所需的酶量。1個Weiss單位相當(dāng)于約200個粘性末端連接單位。
酶活性分析混合物：66 mM Tris-HCl (pH 7.6), 6.6 mM MgCl2, 0.066 mM ATP, 10 mM DTT, 3.3 micro Mol [32PPi]
保存緩沖液
保存緩沖液組分：
20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.1 mM EDTA和50% (v/v)甘油。
10X T4 DNA Ligase 緩沖液(#B69)
400 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 5 mM ATP (pH 7.8, 25°C)。
質(zhì)量控制
相關(guān)測試表明無內(nèi)切和外切脫氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。 功能檢測：粘性末端或平末端DNA的連接能力。
抑制與失活
- 抑制劑：當(dāng)反應(yīng)體系中NaCl或KCl的濃度超過200??mM時，可強(qiáng)烈抑制T4 DNA Ligase活性。
- 失活：65°C加熱10分鐘或者70°C加熱5分鐘。
備注
- 聚乙二醇(PEG) 極大地增加平末端連接效率 (5) 。反應(yīng)體系中的PEG 4000的建議濃度為5% (w/v)。
- T4 DNA Ligase與DNA結(jié)合會改變條帶的瓊脂糖凝膠電泳遷移率。為避免此現(xiàn)象，電泳前需處理樣本或分子量標(biāo)準(zhǔn)。樣本處理方法如下：樣本或分子量標(biāo)準(zhǔn)與Fermentas公司6X DNA Loading Dye & SDS溶液(#R1151)混合；70°C加熱5分鐘或65°C加熱10分鐘后冰浴保存。
- 轉(zhuǎn)化時，連接產(chǎn)物的體積不能超過感受態(tài)細(xì)胞體積的10%。
- 電轉(zhuǎn)化之前，先用氯仿抽提方法除去連接混合物中的T4 DNA Ligase。然后經(jīng)乙醇沉淀純化抽提產(chǎn)物。
訂購信息：
| 貨號 | 產(chǎn)品名稱 | 規(guī)格 |
| EL0014 | T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) | 200 U |
| EL0011 | T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) | 1,000 U |
| EL0012 | T4 DNA Ligase (5 Weiss U/µL) | 5 x 1,000 U |
| EL0013 | T4 DNA Ligase, HC (30 U/µL) | 5000 U |
| EL0016 | T4 DNA Ligase, LC (1 U/µL) | 2x500 U |
了解更多信息，/order/catalog/product/EL0011。
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